Малый практикум по биохимии (стр. 4 )

в) амфотерными свойствами

г) отсутствием специфической конформации молекулы

7. Денатурация белковой молекулы - это:

а) уменьшение растворимости белка при добавлении солей щелочных или щелочноземельных металлов

б) потеря биологической активности белка в результате его гидролиза

в) изменение конформации белка, сопровождающееся потерей его биологической активности

г) конформационные изменения белка в результате взаимодействия с природными лигандами

д) способ укладки полипептидной цепи в пространстве

е) кооперативное изменение конформации протомеров

8. Денатурация белков происходит в результате:

а) деградации первичной структуры

б) агрегации белковых глобул

в) изменений пространственных структур

9. В изоэлектрической точке белок:

а) имеет наименьшую растворимость

б) обладает наибольшей степенью ионизации

в) является катионом

г) является анионом

д) денатурирован

10. При денатурации белка не происходит:

а) нарушения третичной структуры

б) нарушения вторичной структуры

в) гидролиза пептидных связей

г) диссоциации субъединиц

11. Гидратная оболочка у молекул белка возникает вследствие:

а) наличия гидрофобных групп

б) наличия гидрофильных групп

в) изменения осмотического давления среды

г) наличия заряда частиц

д) наличия стабилизатора

е) наличия диффузного слоя ионов

II. Выберите один неправильный ответ:

1. При нагревании раствора белков до 80°С происходит:

а) разрыв слабых связей

б) приобретение молекулами белка случайной конформации

в) нарушение взаимодействия белка с лигандами

г) уменьшение растворимости белков

д) изменение первичной структуры белков

2. Белки денатурируют в результате:

а) действия протеолитических ферментов

б) повышения температуры

в) изменения рН

г) действия солей тяжелых металлов

д) воздействия мочевины

3. В результате денатурации белков:

а) уменьшается их растворимость

б) разрушается нативная конформация

в) молекула занимает больший объем

г) увеличивается доступность белка для действия протеолитических ферментов

д) происходит гидролиз пептидных связей

Практическая часть

Белки, как вещества высокомолекулярные, образуют коллоидные растворы. Растворимость белков в воде определяется наличием гидрофильных групп (несущих заряд или незаряженных) в аминокислотах, входящих в состав белка. Наличие заряда на молекуле белка стабилизирует его в растворе. Кроме заряда, стабилизирующую роль играет водная оболочка, окружающая коллоидную частицу белка. Воздействия, влияющие на гидратацию и заряд белковой молекулы, изменяют и растворимость.

1.  Осаждение белка при нагревании

Ход работы. В пять пробирок наливают по 10 капель 1%-го раствора яичного белка. Содержимое первой пробирки нагревают и наблюдают появление опалесценции (помутнение раствора). Во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1%-го раствора уксусной кислоты, нагревают, наблюдают появление опалесценции, затем выпадение белого хлопьевидного осадка. Объяснить наблюдаемое явление, учитывая, что изоэлектрическая точка яичного альбумина равна 4,6. К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1 – 2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты и нагревают. Объяснить отсутствие осадка в пробирке. К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1 – 2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Объяснить, с чем связано осаждение белка. К раствору яичного белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10%-го раствора гидроксида натрия и нагревают. Объяснить наблюдаемое явление.

Результаты и выводы записать в таблицу.

№	Среда	Наблюдаемые изменения	Выводы
1.	Нейтральная
2.	Слабокислая
3.	Кислая
4.	Кислая среда + электролит
5.	Щелочная

2.  Высаливание белков

Высаливание – обратимая реакция осаждения белков из растворов с помощью больших концентраций нейтральных солей NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4. При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. На процесс высаливания влияет ряд факторов: гидрофильность белка, его относительная молекулярная масса, заряд, в связи с чем для высаливания различных белков требуется разная концентрация одних и тех же солей. Альбумины осаждаются в насыщенном растворе (NH4)2SO4, а глобулины – в полунасыщенном растворе, т. к. у глобулинов большая относительная молекулярная масса, чем у альбуминов. Дегидратирующая способность ионов характеризуется положением ионов в ряду Гофмейстера:

SO42- > Cl - > NO3- > I - > CN-;

Ca2+ > Li+ > Na+ > K+ > Rb+ > Cs+

Белок, осажденный высаливанием, можно отделить от белков, оставшихся в растворе центрифугированием или фильтрованием и вновь растворить, добавив воду или буферный раствор. Метод высаливания широко используется в научно-исследовательских лабораториях при выделении и очистке различных белков (ферменты, гормоны и др.) и в производственных условиях для получения белковых препаратов (лечебные сыворотки, кристаллические белки и др.).

Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка

Ход работы. К 20 каплям 5%-го раствора яичного белка (в 1%-м растворе NaCl) добавляют 20 капель насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором выпадает осадок яичного глобулина. Через 5 минут осадок отфильтровывают. В фильтрате остается другой белок – яичный альбумин. Для высаливания альбуминов к фильтрату добавляют измельченный порошок сульфата аммония до полного насыщения, т. е. новая порция порошка остается нерастворенной. Выпавший осадок отфильтровывают. С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка.

Наличие яичного альбумина в растворе можно показать и прокипятив пробирку с фильтратом, при этом наблюдается осаждение яичного альбумина.

Результаты работы и выводы записывают в таблицу.

Название белка	Степень насыщения	Выводы

3.  Осаждение белков

Вещества, нарушающие структурную организацию белковой молекулы (т. е. четвертичную, третичную и далее вторичную структуры), приводят к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Это явление называется денатурацией.

Денатурирующие факторы делятся на химические, физические и биологические. Наиболее обширны группы химических факторов (кислоты, тяжелые металлы, алкалоиды, поверхностно активные вещества и т. д.) и физических факторов (температура, ионизирующая радиация, ультразвук и т. д.). Биологическую денатурацию могут вызывать протеолитические ферменты (например, трипсин), которые разрушают высшие уровни организации молекулы белка перед тем как гидролизовать ее пептидные связи.

Денатурация изменяет физико-химические свойства белка, в частности, его растворимость. При этом белок становится менее гидрофильным и легко осаждается. Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев удаление денатурирующих агентов приводит к восстановлению исходной конформации молекулы белка и его природных свойств – ренатурации.

При необратимых реакциях осаждения белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть растворимы в первоначальном растворителе. К необратимым реакциям относятся: осаждение белка солями тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, алкалоидными реактивами и осаждение при кипячении.

Осаждение белков солями тяжелых металлов, в отличие от высаливания, происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, ртути и др.) адсорбируют их, образуя солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей, но нерастворимые в воде. Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного положительного заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла в виде нерастворимых осадков в воде используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др. Сразу после отравления обычно применяют белки молока или яиц, пока еще эти соли находятся в желудке и не успевают всосаться. Вслед за дачей молока у больного вызывают рвоту, чтобы удалить яд из организма.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка и образуют комплексные соли белка с кислотами. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. Качественная реакция с концентрированной кислотой лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Стольникова.

Для органических кислот характерен сложный механизм денатурации, связанный с воздействием на водородные связи, с блокированием полярных группировок и с нейтрализацией заряда молекулы белка, что приводит к нарушению пространственной структуры и осаждению белка.

Органические растворители приводят к денатурации белков в результате резкого уменьшения диэлектрической константы их водных растворов. При этом нарушаются их гидрофобные взаимодействия в молекулах белков. Кроме того, увеличиваются электростатические силы взаимодействия между заряженными группами, образование прочных внутри - и межмолекулярных связей приводит к денатурации белков.

Ход работы.

а) Осаждение белка органическими растворителями.

К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка прибавить 20 – 25 капель 96º-го этилового спирта или ацетона. Добавить 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия.

б) Осаждение белка концентрированными минеральными кислотами.

В пробирку налить 10 – 15 капель концентрированной азотной кислоты и, наклонив ее под углом 45°, осторожно, по стенке пробирки добавить из пипетки равный объем 1%-го раствора какого-либо белка. То же можно проделать, взяв вместо азотной кислоты концентрированную серную или соляную кислоту.