Методы определения активности ферментов (стр. 3 )

Условия проведения ферментативной реакции

Ферментативный гидролиз проводят при 7%-ной концентрации субстрата (сахарозы) в течение 5 - 15 мин при 300С. Перед проведением гидролиза раствор субстрата следует термостатировать. Необходимое время гидролиза устанавливается опытным путем. При этом степень гидролиза сахарозы не должна превышать 20 %.

Порядок проведения работы.

В 4 пробирки вносят по 0,6 мл 7%-ного раствора сахарозы, 0,2 мл 0,05М ацетатного буфера и помещают в термостат при 300С. Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 0,2 мл исследуемого ферментного раствора и сразу же в первую пробирку добавляют 4 мл 2М раствора соды; во вторую

пробирку раствор соды добавляют после 5-минутной инкубации, в третью - 10-минутной, а в четвертую - после 15-минутной инкубации.

В полученных гидролизатах определяют содержание инвертного сахара. Для этого из опытных пробирок отбирают по 1 мл исследуемого раствора в другие пробирки, добавляют по 1 мл реактива Шомоджи и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробирки охлаждают и добавляют в них по 1 мл реактива Нельсона. Пробирки тщательно перемешивают и добавляют в каждую по 7 мл дистиллированной воды. Пробы перемешивают в течение 20 мин, затем колориметрируют на ФЭКе при длине волны 595 нм (фильтр №5) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм.

Построение градуировочной кривой

Для расчета инвертазной активности необходимо построить градуировочную кривую зависимости оптической плотности (Д595) от количества инвертного сахара в пробе. Для этого готовят стандартный раствор инвертного сахара. Для этого 1 г сахарозы растворяют в 100 мл воды. 25 мл этого раствора вносят в колбу емкостью 100 мл, добавляют 15 мл 1 М раствора

соляной кислоты. Далее проводят гидролиз в течение 5 мин при 700С. После гидролиза раствор быстро охлаждают, доводят рН до 7, добавляя 2М раствор соды и доводят объем до метки водой. Приготовление проб для построения градуировочной кривой проводят по схеме (табл.2), для этого разводят раствор гидролизата сахарозы в 50 раз и получают раствор сахаров с концентрацией 0,05 мг/мл.

Пробирки помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, охлаждают и добавляют по 1,0 мл реактива Нельсона. Тщательно перемешивают, добавляют по 7 мл дистиллированной воды. Пробы перемешивают в течение 20 мин и колориметрируют при длине волны 595 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм.

Расчет активности

Инвертазную активность в ед/мг вычисляют по формуле:

А = (М2 - М1)*5*1000/0,2*t*с*м. в., где (5.),

М2- количество сахаров в 1 мл пробы после инкубации, мг

М1 - количество сахаров в 1 мл холостой пробы, мг

0,2 - объем ферментного препарата в мл

5 - разбавление по ходу определения

t - время инкубации, мин

с - концентрация белка в 1 мл ферментного препарата, мг/мл

м. в. - молекулярная масса сахаров

1000 - перевод в микромоли.

Таблица2.

Схема приготовления проб

для построения градуировочной кривой по сахарозе

Количество сахарозы в пробе, мкг	Стандартный раствор гидролизата сахарозы мл	Вода, мл	Реактив Шомоджи мл
15	0,3	0,7	1
25	0,5	0,5	1
35	0,7	0,3	1
40	0,8	0,2	1
50	1,0	-	1

5.1. Методы определения активности фосфатаз.

Фосфатазы являются фосфомоноэстеразами, которые катализируют гидролиз фосфоэфирной связи с выходом неорганического ортофосфата согласно следующему уравнению

OH

/ фосфатаза

R - O - P = O + H2O ------------ > R - OH + H3PO4 (6)

\ Mg2+

OH

Kислая фосфатаза катализирует гидролиз монофосфатов в кислой среде, оптимум рН около 5. В качестве субстратов для кислых фосфатаз используются -глицерофосфат, нитрофенилфосфат и другие эфиры фосфорной кислоты.

5. Определение активности кислой фосфатазы

по -глицерофосфату.

CH2OH CH2OH

/ фосфатаза /

CH - O - PO3H2 + H2O ------------ > CHOH + H3PO4 (7)

\ Mg2+ \

CH2OH CH2OH

Метод основан на гидролизе субстрата -глицерофосфата препаратом фермента, находящимся в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента трихлоруксусной кислотой и количественном определении неорганического фосфата, освободившегося в ходе гидролиза.

За единицу активности фермента (Е) принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата в минуту при заданных условиях определения. Активность кислой фосфатазы выражают числом микромолей неорганического фосфата, отщепившихся от -глицерофосфата за 1 мин при 30 0С. Удельную активность выражают числом единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка в ферментном препарате.

Реактивы.

1. Ацетатный буфер 0,2 М, содержащий 0,05 М хлористого магния, рН 5,4

Раствор А - 0,2 М раствор уксусной кислоты. 11,55 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

Раствор Б - 0,2 М раствор уксуснокислого натрия. 27,22 г уксуснокислого натрия растворяют в воде и доводят объем до 1 л.

0,2 М ацетатный буфер рН 5,4 готовится смешением трех объемов раствора А и семи объемов раствора Б и добавлением 10,15 г хлористого магния.

2. Раствор -глицерофосфата натрия 0,02 М. 0,612 г -глицерофосфата натрия растворяют в мерной колбе на 100 мл в небольшом количестве дистиллированной воды. Убедившись в полноте растворения доводят дистиллированной водой до метки.

3. Реактивы для определения фосфора:

5%-ный раствор молибдата аммония.

5 г молибдата аммония растворяют в воде в мерной колбе на 100 мл.

5 М раствор серной кислоты.

К 520 мл дистиллированной воды добавляют 200 мл концентрированной серной кислоты. 24%-ный раствор хлористого олова в концентрированной соляной кислоте. 2,4 г хлористого олова растворяют в 10 мл концентрированной соляной кислоты.

Реактив А готовят смешением 4 мл 5%-ного раствора молибдата аммония, 4 мл 5 М раствора серной кислоты и 8 мл дистиллированной воды.

Реактив В готовят растворением 24 мг аскорбиновой кислоты в 12 мл дистиллированной воды и добавлением 0,1 мл 24%-ного раствора хлористого олова.

Реактивы А и В готовят в день опыта.

Условия проведения ферментативной реакции

Ферментативный гидролиз проводят при 0,004 М концентрации -глицерофосфата в реакционной смеси в течение 20 мин при 30 0С. Перед проведением ферментативной реакции раствор фермента следует термостатировать. Начало гидролиза фиксируется после добавления раствора субстрата. Для прекращения реакции гидролиза прибавляют 12%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, в количестве половины объема реакционной смеси. Количество взятого фермента должно быть рассчитано так, чтобы субстрат присутствовал в избытке и чтобы за время инкубации происходило расщепление 30 - 40 % субстрата. О скорости протекания ферментативной реакции и степени превращения -глицерофосфата судят по количеству освобождающегося неорганического фосфата.

Порядок проведения работы

В 3 пробирки наливают по 0,5 мл ацетатного буфера рН 5,4 и помещают в термостат при 30 0С, затем во все пробирки наливают по 0,3 мл раствора исследуемого ферментного препарата, оптимальная концентрация которого предварительно была определена при различных разведениях фермента (5 - 10 точек). Затем в 2 пробирки добавляют по 0,2 мл субстрата и фиксируют время начала ферментативной реакции. Инкубацию проводят при 30 0C 20 мин. После инкубации в 2 опытные пробирки добавляют 0,5 мл 12%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Третья пробирка является контрольной: к раствору фермента в буфере добавляют 0,5 мл 12%-ного раствора ТХУ, а затем 0,2 мл субстрата и инкубируют вместе с опытными пробирками. Все пробы центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин.

Из надосадочной жидкости отбирают две параллельных пробы по 0,2 мл для определения содержания неорганического фосфора.

Определение неорганического фосфора

Принцип метода заключается во взаимодействии неорганического фосфора с молибденовокислым аммонием с образованием комплекса фосфорномолибденовокислого аммония. Эта соль в присутствии восстановителя превращается в смесь окислов молибдена различной валентности, так называемую молибденовую синь, интенсивность окраски которой колориметрируют при длине волны 720 нм.

Порядок проведения работы

К 0,2 мл надосадочной жидкости приливают 1,8 мл дистиллированной воды, 1,6 мл реактива А (раствор молибдата аммония в серной кислоте), хорошо перемешивают, добавляют 0,4 мл реактива В (аскорбиновая кислота в кислом растворе хлористого олова) и быстро перемешивают. Для развития окраски

пробы оставляют при комнатной температуре на 30 мин и фотометрируют при длине волны 720 нм против контроля. Расчет содержания неорганического фосфора в исследуемых пробах ведут по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой для определения фосфора

Для расчета активности фермента необходимо построить калибровочную кривую по фосфору. Активность фермента определяют путем спектрофотометрического измерения неорганического фосфата.

Для построения калибровочной кривой готовят раствор калия фосфорнокислого однозамещенного. 54,5 мг калия фосфорнокислого однозамещенного, высушенного до постоянного веса растворяют в мерной колбе на 200 мл в дистиллированной воде.