Методы определения активности ферментов (стр. 1 )

Министерство общего и профессионального

образования Российской федерации

———

Санкт-Петербургский Государственный

Технологический институт

/Технический университет/

———————————————

Кафедра технологии микробиологического синтеза

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ФЕРМЕНТОВ

Методические указания

Санкт-Петербург

1997

УДК 577.15 + 577.17

Методы определения активности ферментов:

Методические указания. — СПб; 1997. — 42 с.

Содержит описание методов определения активности некоторых ферментов микроорганизмов, которые используются студентами в лабораторном практикуме по спецкурсу “Биохимические основы синтеза аминокислот, пептидов и белков”.

Предназначены для студентов V курса дневного и вечернего факультетов.

Составитель: канд. мед. наук, доцент

Рецензент: канд. биол. наук, доцент ,

кафедра молекулярной биотехнологии.

Утверждено в качестве методических указаний на заседании методической комиссии II факультета 11.11.96 года.

Рекомендовано к изданию РИСО СпбГТИ (ТУ).

1. Метод определения протеолитической активности.

Метод основан на гидролизе белка казеина препаратом фермента, находящимся в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ).

Протеолитическая активность (ПС) характеризует способность фермента катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот. За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 300С превращает в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние казеин в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг); активность выражается в Е/мг белка.

Активность грибных и бактериальных протеиназ определяют при следующих значениях рН:

2,3 - 2,7 - кислые протеиназы

5,3 - 5,7 - кислые протеиназы

7,0 - 7,4 - нейтральные протеиназы

9,3 - 9,7 - щелочные протеиназы

Реактивы:

1. 0,1 М универсальный буферный раствор

Раствор А - 0,1 М раствор уксусной кислоты. 5,7 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

Раствор В - 0,1 М раствор фосфорной кислоты. 6,45 мл фосфорной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

Раствор С - 0,1 М раствор ортоборной кислоты. 6,18 г ортоборной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

Раствор Д - 1 М раствор едкого натра. 40 г едкого натра растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л.

При смешивании равных объемов растворов А, В и С получают, буферную смесь с рН 1,8. Добавляя к этой смеси 1М раствор едкого натра, получают буферный раствор с нужным значением рН (от 1,8 до 12,0).

2. Рабочий раствор ферментного препарата (рН реакционной смеси 7,0 - 7,4).

0,1 - 1,0 г исследуемого ферментного препарата растворяют в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством 0,1 М универсального буферного раствора с рН 7,2. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят этим же буферным раствором до метки. Последующие разведения производят 0,1 М универсальным буферным раствором с рН 7,2.

3. Раствор субстрата (2% раствор казеина).

2 г казеина растворяют в 90 мл универсального буферного раствора с рН 7,2 (30 мин кипятят на водяной бане),охлаждают. Если рН полученного раствора ниже 7,2, то добавляют по каплям 1 М раствор едкого натра до получения раствора с рН 7,2. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и объем раствора доводят до метки этим же буфером.

Условия проведения ферментативной реакции.

Ферментативный гидролиз проводят при 1%-ной концентрации белка-субстрата в растворе (после смешивания 1 мл раствора субстрата и 1 мл раствора фермента) в течении 10 мин при 30 0С. Перед проведением ферментативной реакции растворы фермента и субстрата следует термостатировать. Для прекращения реакции гидролиза и осаждения непрогидролизованной части субстрата прибавляют 2 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, встряхивают, выдерживают 20 мин при 30 0С и фильтруют. Количество взятого фермента должно быть рассчитано так, чтобы присутствовал большой избыток субстрата и чтобы измеряемые величины оптической плотности при спектроскопировании лежали в области от 0,2 до 0,6 для нейтральных протеиназ.

Определение протеолитической активности проводят при различных разведениях рабочего раствора фермента (5-8 точек).

Порядок проведения работы

По 1 мл субстрата вливают в пять(восемь) пробирок и помещают в термостат при 30 0С. Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 1 мл раствора фермента определенного разведения, пробирки встряхивают и оставляют на гидролиз ровно на 10 мин при 30 0С. Через 10 мин добавляют во все пробирки по 2 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Быстро перемешивают смесь и для обеспечения полного осаждения выдерживают при 30 0С еще 10 мин. Затем фильтруют через маленькие воронки с бумажными фильтрами в сухие пробирки. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. В фильтрате измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 280 нм против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10мм.

Контрольный опыт готовят прибавляя реактивы в обратной последовательности: к 1 мл ферментного раствора того же раз-ведения, что и в опыте, добавляют 2 мл 5%-ного раствора ТХУ, выдерживают в термостате при 30 0С 10 мин, а затем вносят 1 мл субстрата. Через 20 мин нахождения в термостате раствор фильтруют.

Построение градуировочной кривой

Для расчета протеолитической активности необходимо построить градуировочную кривую по тирозину. Затем по градуировочной кривой вычислить тирозиновый эквивалент, т. е. ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 мл стандартного раствора. Этот эквивалент необходимо установить для каждого спектрофотометра. Для построения градуировочной кривой готовят раствор тирозина с концентрацией 0,001 М. Для этого 181,19 мг чистого тирозина растворяют в 0,2 М растворе соляной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 л. Из этого исходного раствора готовят растворы тирозина разной концентрации: от 0,02 до 0,3 мкмоль. В сухие кюветы по 3 мл раствора тирозина разной концентрации и определяют оптическую плотность при длине волны 280 нм и толщине поглощающего слоя 10 мм против дистиллированной воды. Следует приготовить растворы из двух навесок тирозина и провести описанным выше способом два параллельных опыта. По средним данным, полученным из двух опытов, строят градуировочную кривую. На оси абсцисс откладывают количество тирозина (с) в мкмоль/мл, на оси ординат - соответствующие значения оптической плотности (Д). Тогда градуировочная кривая будет иметь вид, представленный на рис.1.

Расчет активности

Протеолитическую активность (ПА) в Е/мл ферментного раствора вычисляют по формуле:

Д * Vрс

ПА =------------------------ Е/мл (1),

ТЭ * 10 * Vе

Д - оптическая плотность, измеренная на спектрофотометре

ТЭ - тирозиновый эквивалент, определяемый по градуировочной кривой, мкмоль/мл

10 - время гидролиза субстрата, мин

Vе - объем ферментного раствора, взятого для гидролиза

Vрс - объем реакционной среды после добавления ТХУ

Т. о., по этой формуле находят активность 1 мл ферментного раствора для 5 - 8 разведений рабочего раствора фермента. Далее определяют содержание белка в исходном рабочем растворе фермента (по методу Лоури) и рассчитывают содержание белка в 5 - 8 разведениях фермента. Строят график зависимости активности фермента (скорости реакции) от концентрации белка в растворе. На оси абсцисс откладывают содержание белка в растворе (мг/мл), а на оси ординат - соответствующую протеолитическую активность (Е/мл).

Выявив содержание белка, при котором скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента в реакционной среде, вычисляют удельную активность:

ПА уд = ПА / с Е/мг (2),

с - количество белка (в мг) в 1 мл ферментного раствора, взятого для протеолиза

2. Метод определения протеолитической активности окрашенных растворов.

При определении протеолитической активности ферментных препаратов, имеющих окраску, после осаждения ТХУ может получиться окрашенный фильтрат. В этом случае определение продуктов гидролиза казеина проводится с реактивом Фолина.

Порядок проведения работы

Заполнение проб проводят как в работе 1. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 2 мл 5%-ного раствора ТХУ, смесь перемешивают, выдерживают для обеспечения полного осаждения непрогидролизованного белка и фильтруют. Отбирают 1 мл окрашенного фильтрата, добавляют 5 мл 0,5 М Na2CО3 и 1 мл реактива Фолина (разведение 1:3), выдерживают 20 мин в темноте и фотометрируют при 670 нм против контрольной пробы

в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Контрольный опыт готовят, прибавляя реактивы в обратной последовательности: к 1мл ферментного раствора того же разведения, как в опыте, добавляют 2 мл 5%-ного раствора ТХУ, а затем вносят 1 мл субстрата. Через 10 мин нахождения в термостате раствор фильтруют.

Построение градуировочной кривой

Для расчета протеолитической активности строят градуировочную кривую по тирозину. Готовят раствор тирозина концентрации 1*10-3 М. Для этого 181,19 мг чистого тирозина растворяют в 0,2 М растворе соляной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 л. Из этого исходного раствора готовят растворы тирозина разной концентрации: от 2*10-4 до 8*10-4. В пробирки наливают по 1 мл раствора тирозина разной концентрации. Добавляют 5 мл 0,5 М Na2CО3 и 1 мл рабочего раствора Фолина, выдерживают 20 мин в темноте и фотометрируют при 670 нм против контроля. В контрольную пробу вместо тирозина наливают 1 мл дистиллированной воды. По полученным данным строят градуировочную кривую (см. рис. 1), по которой определяют молярный коэффициент экстинкции тирозина в мкмоль/мл.

Расчет активности проводят по уравнениям 1 и 2.