Методы определения активности ферментов (стр. 4 )

В 1 мл полученного раствора будет содержаться 62 мкг фосфора. При последующем разведении этого раствора в 10 раз в 1 мл будет содержаться 6,2 мкг фосфора. Этот раствор служит рабочим для построения калибровочного графика.

Таблица 3

Заполнение проб для построения калибровочного графика

по фосфору

пробы	мкг фосфора в пробе	рабочий раствор мл	вода мл	реактив А мл	реактив В мл
1	0.62	0.1	1.9	1.6	0.4
2	1.24	002	1.8	1.6	0.4
3	1.86	0.3	1.7	1.6	0.4
4	2.48	0.4	1.6	1.6	0.4
5	3.10	0.5	1.5	1.6	0.4
6	3.72	0.6	1.4	1.6	0.4
7	4.34	0.7	1.3	1.6	0.4
8	4.96	0.8	1.2	1.6	0.4
9	5.56	0.9	1.1	1.6	0.4
10	6.20	1.0	1.0	1.6	0.4
K	-	-	2,0	1.6	0.4

Интенсивность окраски измеряется на колориметре при длине волны 720 нм против контрольной пробы. Следует приготовить растворы из двух навесок калия фосфорнокислого однозамещенного и провести описанным выше способом 2 параллельных опыта. По средним данным, полученным из двух опытов строится градуировочная кривая. На оси абсцисс откладывают количество мкг фосфора в пробе (с), на оси ординат - соответствующее значение оптической плотности (Д).

Расчет активности фермента

Фосфатазную активность Е/мг вычисляют по формуле:

А = М*1,5 / 0,2*0,3*t*м. в.*с, где (8)

М - количество фосфора в 0,2 мл инкубационной среды, найденное по градуировочной кривой (мкг);

0,2 - объем пробы для анализа фосфора (мл);

1,5 - объем инкубационной среды (мл);

0,3 - объем ферментного препарата (мл);

м. в.- молекулярная масса фосфора;

t - время инкубации (мин);

с - концентрация белка в мл ферментного препарата (мг).

5.2. Определение активности кислой фосфатазы

по p-нитрофенилфосфату.

Метод основан на гидролизе субстрата p-нитрофенилфосфата исследуемым препаратом кислой фосфатазы с последующей инактивацией фермента изменением значения рН в щелочную область и количественном определении освободившегося p-нитрофенола.

Активность кислой фосфатазы выражают числом микромолей p-нитрофенола, отщепившегося в процессе гидролиза p-нитрофенилфосфата, или, иначе, числом микромолей субстрата, расщепившегося за 1 мин при 30 0С.

Условия ферментативной реакции

Реакция гидролиза p-нитрофенилфосфата начинается после добавления субстрата в термостатированную при 30 0С инкубационную среду, содержащую ферментный препарат в буферном растворе при рН 4,0 , и прекращается при сильном изменении рН в щелочную область после добавления NаОН.

Реактивы

1. 0,2 М ацетатный буфер рН 3,8 - 4,0

2. 1 М едкий натр

3. p-нитрофенилфосфат 0,038 М

4. Рабочий раствор фермента

Порядок проведения работы

В две пробирки наливают по 1,6 мл ацетатного буфера 0,2 М рН 4,0, пробирки термостатируют при 30 0С 10 мин, добавляют 0,2 мл раствора ферментного препарата, перемешивают и добавляют 0,2 мл 0,038 М раствора субстрата. Пробирки инкубируют 15 мин при 300С. Ферментативную реакцию гидролиза останавливают добавлением 1 мл 1 М раствора едкого натра. В контрольную пробирку наливают буфер - 1,6 мл, субстрат - 0,2 мл, инкубируют 15 мин, добавляют 1 мл щелочи и в конце добавляют 0,2 мл фермента.

Опытные пробы спектрофотометрируют против контрольной при длине волны 405 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм.

Определение количества освободившегося р-нитрофенола проводят по калибровочной кривой (рис.2)

Расчет активности проводится по формуле:

Таблица 4

Заполнение проб для построения калибровочного графика

по р-нитрофенолу

N пробы	рабочий раствор мл	ацетатный буфер, рН	NаОН мл	Концентрация р-нитрофенола мкМ/мл	Д405
1	0,1	1,9	1,0	0,0066
2	0,2	1,8	1,0	0,0133
3	0,3	1,7	1,0	0,0200
4	0,4	1,6	1,0	0,0266
5	0,5	1,5	1,0	0,0330

Ауд = Д*3 / 0,2*МЭ*с*t, где (10)

Д - оптическая плотность при длине волны 405 нм;

0,2- объем ферментного раствора, мл;

3 - объем инкубационной среды, мл;

МЭ - молярный коэффициент экстинкции р-нитрофенола, рассчитанный по калибровочной крив

ой, мкмоль/мл;

с - концентрация белка в 1 мл ферментного раствора, мг/мл;

t - время инкубации, мин

Построение калибровочной кривой

Для расчета фосфатазной активности по р-нитрофенилфосфату необходимо построить калибровочную кривую по р-нитрофенолу и вычислить по ней молярный коэффициент экстинкции, то есть оптическую плотность раствора, содержащего 1 М р-нитрофенола в 1 л стандартного раствора или 1 мкмоль/мл. Этот коэффициент необходимо установить для каждого спектрофотометра.

Для этого готовят исходный раствор р-нитрофенола с концентрацией 0,139 мг/мл (1 мкМ/мл). Рабочий раствор с концентрацией 0,2 мкМ/мл готовят разбавлением исходного в 5 раз. Схема заполнения проб для построения калибровочного графика представлена в таблице 4

5.3. Определение активности кислой фосфатазы

по фенолфталеинфосфату.

Метод основан на гидролизе субстрата фенолфталеинфосфата препаратом фосфатазы с последующей инактивацией фермента изменением значения рН в щелочную область и количественном определении освободившегося фенолфталеина. Активность фермента выражают числом микромолей фенолфталеина, отщепившегося в процессе ферментативного гидролиза фенолфталеинфосфата, или иначе числом микромолей субстрата, расщепившегося за 1 мин при температуре 300С.

Реактивы

1.  Ацетатный буфер 0,1 М, рН 3.8 - 4,0

2.  Едкий натр 1 М

3.  Исходный 10 %-ный раствор фенолфталеинфосфата натрия в аммонийном буфере.

Рабочий раствор субстрата готовят разбавлением исходного раствора в 50 раз 0,1 М ацетатным буфером рН 4,0. При этом получают 0,2 %-ный (0,0036 М) раствор субстрата в аммонийно-ацетатном буфере

Условия гидролиза

Реакция гидролиза фенолфталеинфосфата натрия начинается сразу после добавления в него ферментного препарата и прекращается после добавления 1М раствора NаОН. Ферментативный гидролиз проводят при 0,0012М концентрации фенолфталеинфосфата в реакционной смеси в течение 15 мин при 300С.

Порядок проведения работы

В две пробирки наливают по 2 мл рабочего раствора субстрата, добавляют по 1 мл исследуемого раствора фермента инкубируют в течение 15 мин при 3О0С. По истечении времени инкубации в пробы добавляют по 1 мл 1 М раствора NаОН и колориметрируют против контроля при длине волны 540 нм в кюветах толщиной 5 мм. Контролем является выдержанная в течение срока инкубации пробирка с 2 мл субстрата, в которую после термостатирования добавляют 1 мл 1 М раствора NаОН и 1 мл ферментного раствора.

Расчет активности фермента

Фосфатазную активность Е/мг вычисляют по формуле:

Ауд = Д*Vинк. ср. / МЭ*Vе*t*c, где (11)

Д - оптическая плотность опытной пробы при длине волны 540 нм

МЭ - молярный коэффициент экстинкции фенолфталеина, рассчитанный по калибровочной кривой (рис.3), мкмоль/мл

Vе - объем ферментного раствора, мл

Vинк. ср.- объем инкубационной среды после добавления 1М NаОН, мл

t - время инкубации, мин

с - концентрация белка в 1 мл ферментного раствора, мг/мл

Построение калибровочной кривой

Для расчета фосфатазной активности по фенолфталеинфосфату необходимо построить калибровочную кривую по фенолфталеину и вычислить молярный коэффициент экстинкции, то есть оптическую плотность, которую дал бы 1 Моль фенолфталеина в 1 л стандартного раствора, или 1 мкМоль в мл. Этот коэффициент необходимо установить для каждого колориметра. Для этого

растворяют 50 мг фенолфталеина в 50 мл спирта и доводят водой до метки в мерной колбе емкостью 100 мл. Разбавлением этого исходного раствора готовят рабочий раствор с концентрацией фенолфталеина 0,2 мг/мл (0,628 мкМоль/мл). Схема заполнения проб для построения калибровочного графика представлена в табл.5

Следует приготовить растворы из двух навесок фенолфталеина и провести описанным выше способом два параллельных опыта. По средним данным, полученным из двух опытов, строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают количество фенолфталеина в мкмоль/мл, а на оси ординат - соответствующее значение оптической плотности. Затем по градуировочной

кривой рассчитывают молярный коэффициент экстинкции, который используют в формуле (11).

Таблица 5

Заполнение проб для построения калибровочного графика

по фенолфталеину

N пробы	Рабочий раствор мл	Вода	NаОН мл	Концентрация фенолфталеина мкМоль/мл	Д540
1	2,0	1,0	1,0	0,310
2	1,5	1,5	1,0	0,240
3	1,0	2,0	1,0	0,157
4	0,5	2,5	1,0	0,079
5	0,4	2,6	1,0	0,062
6	0,3	2,7	1,0	0,031
7	0,2	2,8	1,0	0,016