5.4 Определение активности щелочной фосфатазы
по р-нитрофенилфосфату.
Метод основан на гидролизе субстрата р-нитрофенилфосфата в щелочной среде исследуемым препаратом фосфатазы и количественном определении освободившегося р-нитрофенола (уравнение 9).
Активность щелочной фосфатазы выражают числом микромолей р-нитрофенола, отщепившегося в процессе гидролиза р-нитрофенилфосфата или, иначе, числом микромолей субстрата, расщепившегося за 1 мин при комнатной температуре.
Условия ферментативной реакции
Реакция гидролиза р-нитрофенилфосфата начинается сразу после добавления субстрата в термостатированную при 30 0С инкубационную среду, содержащую ферментный препарат в 0,05 М глицериновом буфере (рН 10,6). О ходе ферментативной реакции судят по изменению поглощения при 400 нм.
Реактивы
1. Глициновый буфер 0,05 М рН 10,6;
2. р-нитрофенилфосфат 0,038 М;
3. Рабочий раствор фермента.
Порядок проведения работы
В кювету наливают 2,2 мл буферного раствора, добавляют 0,5 мл ферментного препарата, перемешивают и добавляют 0,3 мл 0,038 М раствора субстрата. В контрольную кювету налива наливают 2,5 мл буфера и 0,5 мл ферментного раствора. Перемешивают и измеряют против контрольной кюветы увеличение оптической кой плотности при 400 нм в течение 20 - 30 мин.
Расчет удельной активности проводят по формуле:
Ауд = Д*3 / 0,5*МЭ*t*c, где (12)
Д - изменение оптической плотности при 400 нм за время t;
0,5 - объем ферментного препарата, мл;
3 - объем инкубационной среды, мл;
МЭ - коэффициент молярной экстинкции р-нитрофенола (см. работу 1.6), мкмоль/мл
с - содержание белка в 1 мл ферментного препарата, мг/мл;
t - время инкубации, мин.
6. Метод определения активности 
-галактозидазы
-галактозидаза (лактаза) катализирует гидролиз 1-4-глюкозидной связи в -галактозидоглюкозе (лактозе) на галактозу и глюкозу. Поскольку сама лактоза и продукты ее гидролиза обладают восстановительными свойствами, определение активности -галактозидазы по скорости расщепления природного субстрата, т. е. по количеству образующихся моносахаридов (как, например, при определении активности инвертазы) не представляется возможным. Поэтому об активности -галактозидазы судят по скорости расщепления синтетического субстрата 2-нитрофенил--Д-галактопиранозида, являющегося аналогом лактозы и отличающегося от нее наличием нитрофенола вместо глюкозы. Реакция, катализируемая -галактозидазой, протекает по уравнению:
Активность в-галактозидазы выражают числом микромолей р-нитрофенола, отщепившегося в процессе гидролиза субстрата за за 1 мин при 30 0С.
Условия проведения ферментативной реакции
Ферментативный гидролиз проводят при 0,001 М концентрации субстрата в инкубационной среде в течение 20 мин при 300С. Перед проведением ферментативной реакции раствор фермента в фосфатном буфере следует термостатировать. Время начала гидролиза фиксируют после добавления раствора субстрата. В процессе реакции освобождается р-нитрофенол, окрашивающий раствор в желтый цвет. Для прекращения реакции гидролиза добавляется 0,5 мл сильнощелочного раствора карбоната натрия. Количество взятого фермента должно быть рассчитано так, чтобы субстрат присутствовал в избытке и чтобы измеряемые величины оптической плотности при спектроскопировании лежали в области 0,3 - 0,4.
Реактивы
1. 0,1 М фосфатный буфер рН 7,0
Раствор А - 0,2 М раствор Na2HPO4. 35,81 г Na2HPO4 растворяют в 500 мл дистиллированной воды.
Раствор Б - 0,2 М раствор NaH2PO4*2Н2O, 3,12 г NaH2PO4*2Н2O растворяют в 100 мл дистиллированной воды. 435 мл раствора А и 65 мл раствора Б смешивают в колбе объемом 1 л и доводят водой до метки.
2. 0,01 М раствор р-нитрофенил--Д-галактозида (М. м. 301,26). Раствор субстрата готовят в день опыта в объеме, определяемом задачей эксперимента.
3. Рабочий раствор фермента готовят разведением основного раствора фермента так, чтобы степень гидролиза субстрата за 20 мин инкубации не превышала 50 %. Основной раствор разводится 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0.
4. 2 М раствор Na2CO3. 212 г безводного углекислого натрия взвешивают на технических весах, переносят в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем дистиллированной водой до метки.
Порядок проведения работы
В 3 пробирки вливают по 2,6 мл раствора 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0, в 2 опытных пробирки добавляют по 1 мл рабочего раствора фермента и помещают в термостат. Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 0,4 мл раствора субстрата - нитрофенилгалактопиранозида, перемешивают и инкубируют 20 мин при 30 0С. Через 20 мин во все 3 пробирки наливают по 0,5 мл 2М раствора карбоната натрия, а в третью (контрольную) пробирку наливают 1 мл рабочего раствора ферментного препарата. В опытных пробирках определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 405 нм против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Для определения количества освободившегося р-нитрофенола используют градуировочную кривую по р-нитрофенолу (рис.2)
Расчет удельной активности в-галактозидазы проводят по формуле:
Ауд = Д*Vинк. ср. / MЭ*Ve*t*c, где (13)
Д - оптическая плотность, измеренная на спектрофотометре при 405 нм;
МЭ - молярный коэффициент экстинкции, определяемый по калибровочной кривой (рис.2), мкмоль/мл;
Vинк. ср.- объем инкубационной среды, мл
Vе - объем ферментного раствора, мл
t - время гидролиза, мин
с - содержание белка в 1 мл ферментного препарата, взятого для гидролиза, мг
ЛИТЕРАТУРА
1. Кочетов руководство по энзимологии.- М.: Высшая школа,1981,с.272.
2. ГОСТ 20264.2-74. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности.
3. ГОСТ 20264.4-74. Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Метод определения протеолитической активности 3
2. Метод определения протеолитической активности
окрашенных растворов 9
3. Метод определения амилолитической активности 11
4. Метод определения активности инвертазы
(в-фруктофуранозидазы) 16
5. Методы определения активности фосфатаз 22
5.1. Определение активности кислой фосфатазы
по -глицерофосфату 22
5.2. Определение активности кислой фосфатазы по
р-нитрофенилфосфату 28
5.3. Определение активности кислой фосфатазы по
фенолфталеинфосфату 32
5.4. Определение активности щелочной фосфатазы
р-нитрофенилфосфату 36
6. Метод определения активности в-галактозидазы 38
Литература 42
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 |
