Спецпрактикум кафедры химической энзимологии (стр. 3 )

1.  Классификация носителей для иммобилизации ферментов и обсудить области их возможного применения (привести примеры);

2.  Методы иммобилизации – их применение (привести примеры)

3.  Ковалентная «пришивка» фермента к носителю.

Активация функциональных групп носителей (привести уравнения реакции)

4.  Особенности (характеристики и свойства) иммобилизованных ферментов

Здесь мы рассмотрим наиболее часто употребляемые методы при получении белок-содержащих систем для применения в биотехнологии и медицине.:

·  образование интерполиэлектролитных и фермент-полиэлектролитных комплексов,

·  инкапсулирование биомолекул

·  включение в липосомы или обращенные мицеллы ПАВ,

·  образование коньюгатов с полиспиртами ПЭГ и блоксополимерами, плюрониками и проксанолами.

Интерполиэлектролитные и Белок-Полиэлектролитные комплексы

Метод образования интерполиэлектролитных комплексов широко применяется для получения белок-содержащих коллоидных частиц, а также при создании оболочки микрокапсул. Преимуществом данного метода является технологичность, мягкие условия получения и наоборот - деградации, а также возможность целенаправленного контроля свойств частиц: размера, который может варьироваться от 50-100 нм до микрометров; функциональных, гидродинамических, поверхностных свойств частиц. Белок-полиэлектролитные комплексы (БПЭК) спонтанно образуются, в основном, за счет электростатических взаимодействий противоположно заряженных групп полиэлектролитной пары или пары белок-полиэлектролит (рис. 4.).

Рис. 4. Образования белок-полиэлектролитных комплексов.

БПЭК устойчивы в широком интервале значений рН и ионной силы и отличаются высокой стабильностью благодаря кооперативному характеру взаимодействия. Состав и свойства БПЭК зависят от таких параметров как рН, ионная сила, количество зарядов на поверхности белка, его изоэлектрическая точка и степень полимеризации полиэлектролита. При изменении рН меняется количество зарядов на поверхности белковой глобулы (рис. 5.), что приводит к изменению числа межмолекулярных контактов между белком и полиэлектролитом, в результате чего меняется состав комплекса, его структура и общий размер частицы. Например, если комплекс состоит из белка и поликатиона, то снижение рН приводит к увеличению "емкости" поликатиона по молекулам белка при неизменной длине поликатиона. При этом уменьшается число межмолекулярных контактов в комплексе в расчете на одну глобулу белка.

Рис. 5. Зависимость количества положительных (1) и отрицательных (2) зарядов на поверхности белка от рН среды. рI - изоэлектрическая точка белка.

Наличие в системе низкомолекулярного электролита оказывает влияние на характеристический состав БПЭК. При увеличении ионной силы низкомолекулярный электролит начинает конкурировать с полиэлектролитом за солевые связи с белком, что приводит к уменьшению "емкости" полиэлектролита по белку.

При низкой ионной силе для БПЭК наблюдается образование неравновесного комплекса. Для того, чтобы образовался равновесный БПЭК необходимо добавлять небольшое (5-10 мМ) количество соли в растворы полиэлектролита и белка. При высокой концентрации соли (свыше 0,5 М) происходит полное разрушение комплекса белка с полиэлектролитом, а сильное обессоливание (методом диализа) системы приводит к электростатической дестабилизации частиц БПЭК. При этом увеличивается вязкость среды, что связано с образованием крупных агрегатов, которые при добавлении соли восстанавливают свойства БПЭК.

Каталитическая активность ферментов в комплексе с ПЭ

Образование комплекса с ПЭ, как правило, не приводит к изменению каталитических параметров ферментов. Катализ ферментами в комплексе с полиэлектролитами как правило описывается схемой Михаэлиса-Ментен. В ряде случаев наблюдаеются увеличение каталитической активности ферментов за счет эффектов микросреды, образуемой полиэлектролитной оболочкой, может наблюдаться также уменьшение константы Михаэлиса в 2-5 раз для низкомолекулярных субстратов, но чаще всего кинетические константы остаются практически неизменными.

Для ферментов, включенных в комплекс с полиэлектролитом наблюдается: сохранение каталитических свойств; повышение устойчивости к действию протеолитических ферментов; повышение термостабильности, и стабильности при хранении, часто наблюдается изменение рН профиля зависимости каталитической активности.

s Студенты при сдаче коллоквиума по данной теме должны уметь объяснить:

а) за счет чего может увеличиваться стабильность ферментов?

б) за счет чего может меняться рН профиль зависимости каталитической активности ферментов при образовании комплексов с полиэлектролитами?

в) Какие свойства обуславливают применимость ИПЭК и фермент-ПЭ комплексов в биотехнологии и медицине?

Для получения нерастворимых в воде комплексов применяют метод образования тройных комплексов белок-полианион-поликатион, в которых белок связан с обоими ПЭ и в которых регулируется число нескомпенсированных зарядов на полиэлектролитах путем подбора условий. Данный принцип образования комплексов применяют, например, при синтезе белок-содержащих многослойных полиэлектролитных капсул.

Многослойные полиэлектролитные капсулы

Многослойные полиэлектролитные капсулы – можно расматриватиь как универсальные мультифункциональные носители. Полиэлектролитные капсулы состоят из следующих блоков: (1) Полиэлектролитные оболочка капсул; (2) Включаемые целевые биомолекулы; (3) Дополнительные функциональные агенты (магнитные, флуоресцентные молекулы или частицы, коллоидные частицы драгоценных металлов, золота или серебра) (рис. 6.).

Многофункциональные полиэлектролитные капсулы

Дополнительные функциональные молекулы/частицы

Включаемые вещества: Биомакромолекулы, лекарства

 

Полиэлектролитная оболочка капсулы

 

Белки, антитела, ферменты

ферромагнитные частицы

локальный перегрев капсул, коллоидные частицы Au, Ag

Искусственные ПЭ

ДНК, лекарства

Природные ПЭ: полисахариды

флуоресцентные молекулы, частицы квантовые точки

Рис. 6. Структура многослойных полиэлектролитных капсул

Синтез многослойных полиэлектролитных капсул проводят послойной адсорбцией полиэлектролитов (поочередно, поликатионов и полианионов) на противоположных по заряду сферических частицах (рис. 7). Частицы могут быть полистиреновые, силикагельные, карбонатные, (MnCO3, CaCO3, CdCO3), а также это могут быть биологические клетки. После окончания процесса послойной адсорбции сферическая частица, служившая в качестве матрицы при синтезе полиэлектролитных капсул удаляется (например, методом растворения) без повреждения структуры полиэлектролитной оболочки.

Рис. 7. Синтез многослойных полиэлектролитных капсул.

Для растворения ядра полиэлектролитных капсул используют растворы соляной кислоты, раствор ЕДТА и др. в зависимости от химической природы материала. Размер внутренней полости капсул регулируется размером используемой в качестве матрицы частицы, размер которой и соответственно размер внутренней полости капсул может варьироваться от 20 до нескольких сотен нанометров. Отметим, что для использования в медицинских целях при синтезе многослойных полиэлектролитных нанокапсул используют биосовместимые материалы природные полисахариды и белки (подробное описание материалов приведено выше).

Споcобы инкапсулирования целевых функциональных биомолекул. Существует несколько способов включения биомолекул в полимерные капсулы. Одна из стратегий основана на использовании ферментов в кристаллическом состоянии или клеток в качестве ядра (матрицы) капсул, на которые послойно адсорбируют полиэлектролитные оболочки. Активность инкапсулированного фермента при этом польностью сохраняется, сохраняются также нативные функциональные свойства клеток. Недостатком такого способа является невозможность получения монодисперстных частиц и невозможность четкого контроля формы, размеров и других параметров частиц.