Спецпрактикум кафедры химической энзимологии (стр. 4 )

Другой метод основан на возможности включать биомолекулы в полиэлектролитные нанокапсулы незамедлительно после растворения матрицы (ядра) капсулы. Например, существует возможность регулировать проницаемость полиэлектролитной оболочки капсул изменением условий, например, изменяя значение рН и полярность растворителя, переводя капсулы из «закрытого» состояния в «открытое» и обратно. Так, при понижении рН и в присутствии этанола структура полиэлектролитного комплекса становится более рыхлой и полиэлектролитная оболочка становится проницаемой и доступной для включения белков. После включения целевых биомолекул, полиэлектролитная капсула переводится в «закрытое состояние» путем изменения условий среды (рис. 8.). Преимуществом данного метода является возможность синтезировать монодисперстные нанокапсулы заданного размера внутренней полости, используя в качестве матрицы при синтезе полиэлектролитных капсул комерчески доступные полимерные частицы.

Рис. 8. Включение функциональных биомолекул методом регулирования проницаемости полиэлектролитной микрокапсулы

Альтернативным методом включения целевых функциональных биомолекул является предварительная адсорбция целевых биомолекул на порах наночастиц (например, карбонатных кристаллов), используемых в качестве матрицы при синтезе полиэлектролитных капсул с последующим растворением матрицы в мягких условиях, низких рН или в присутствии ЕДТА. Недостатком подхода является методические трудности при получении монодисперстных карбонатных наночастиц.

Помимо включения целевых биомолекул, полиэлектролитным капсулам можно придавать дополнительные функциональные свойства. Например при включении полупроводниковых коллоидных наночастиц CdSe или CdTe (квантовых точек) капсуле придают флуоресцентные свойства и тем самым, возможность детекции наночастиц (рис. 6.).

Путем включения магнитных наночастиц, Fe3О4, капсулам придают контролируемую подвижность в требуемом направлении с заданной скоростью, которую регулируют, применяя внешний градиент магнитного поля.

Включение коллоидных частиц благородных металлов, золота или серебра в полиэлектролитные слои позволяет регулировать проницаемость полиэлектролитных капсул или инициировать их разрушение. Метод основан на том, что поглощении света частицами золота или серебра приводит к локальному перегреву полиэлектролитных капсул, что ведет к разрушению капсулы и выбросу целевых молекул (лекарства) (рис. 10).

Физико-химические методы контроля свойств частиц

Для контроля свойств полиэлектролитных капсул и/или роста полиэлектролитных слоев на сферической матрице при синтезе частиц используют ряд физико-химических методов, светорассеяние, электрофоретическая подвижность, за структурой частиц обычно следят методом атомно-силовой микроскопии.

Метод лазерной сканирующей микроскопии (или флуоресцентной микроскопии) используется для наблюдения в реальном времени и в условиях in vivo за свойствами нанокапсул, их подвижностью, проникающей способности, поглощения клеткой, и доставкой инкапсулированных материалов.

Контролируемая доставка и выброс лекарства. Механизм контролируемого выброса лекарства основан на разрушении или регуляции проницаемости оболочки нанокапсул с применением физических методов (свет, ультразвук, радиоволны).

Рис. 9. Контролируемый выброс лекарства путем разрушения нанокапсулы под воздействием лазерного света. (i) Направленный лазерный луч вызывает локальный нагрев частиц коллоидного золота (содержащихся в нанокапсуле), что приводит к светоразрушению капсулы и высвобождению инкапсулированного материала.

Таким образом, многослойные полиэлектролитные капсулы являют собой мультифункциональные наносистемы, с четко регулируемыми свойствами.

Инкапсулирование альгинат-хитозан. Основная область применения - для доставки лекарств, инкапсулирование обеспечивает устойчивость лекарств (в том числе, белков) к био - и кислотной деградации в желудочно-кишечном тракте, а также пролонгированое действие лекарств.  

Одним из наиболее широко применяемых методов для придания требуемых свойств лекарственным средствам на основе белков является инкапсулирование биоактивных молекул с использованием альгината, каррагинана, коллагена, желатины, целлюлозы, а также некоторых синтетических полимеров. Белки включенные в такие частицы характеризуются высокой биологической и термостабильностью, устойчивостью к изменению рН, улучшенным (в том числе, более пролонгированным) лечебным эффектом и возможностью направленной доставки.

Существует два принципиально различных способа инкапсулирования биомолекул. Первый способ – метод внешнего гелеобразования. Раствор альгината, содержащий инкапсулируемый материал (белок) с помощью специального «микроразбрызгивателя» вносят в раствор хлорида кальция. «Микроразбрызгиватель» - (или пульверизатор) позволяет получать однородные капли заданного размера. При контакте альгината с ионами кальция немедленно образуются сферические полимерные белок-содержащие частицы. Гелеобразование происходит в направлении от поверхности к центру частиц. Поэтому рассматриваемый метод называют способ внешнего гелеобразования.

Рассмотрим метод внутреннего гелеобразования при инкапсулировании биомолекул с использованием альгината (рис. 10). Иммобилизацию биомолекул на частицах альгината проводят следующим образом: к раствору альгината добавляют твердый измельченный карбонат кальция. Полученную смесь эмульгируют в растительном масле, содержащем ПАВ (SPAN 80). Гелеобразование инициируют понижением рН системы (добавлением 0.2% уксусной кислоты). Частицы геля промывают от масла. На полученных сферических частицах адсорбируют фермент, после чего покрывают пленкой хитозана по механизму электростатического комплексообразования.

Вопросы студентам:

1) при каких значениях рН (интервал) следует проводить адсорбцию фермента? наносить на фермент-содержащие частицы хитозановое покрытие?

2) Как можно определить эффективность (выход) инкапсулирования (по ферменту?)

Рис. 10. Инкапсулирование ферментов на альгинат-хитозановых частицах.

В заключении отметим, преимуществом инкапсулирования методом внутреннего гелеобразования путем эмульгирования является возможность получения частиц заданного размера, варьированием условий (содержания воды, ПАВ в системе).

Включение ферментов и других биологически активных молекул в липосомы

Искусственные липопротеидные комплексы, липосомы, обращенные мицеллы, часто применяются в биологии для изучения мембраноактивных белков и моделирования различных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы часто используют в медицине и косметике, поскольку такие системы по своим свойствам близки к природным мембранам. Основное применение липосом в области медицины – создание биосовместимых носителей для направленной доставки биоактивных молекул, лекарств.

Липосомы представляют собой частицы, которые образованы одним или несколькими концентрическими замкнутыми липидными бислoями, внутренний объем которых изолирован от внешней среды. В зависимости от размера частиц и числа образующих их липидных слоев различают следующие липосомы: 1) малые моноламеллярные, образованные одиночным липидным бислоем (диаметр 20-50 нм); 2) крупные моноламеллярные (макровезикулярные), образованные также одиночным бислоем (диаметр 50-200 нм и выше); 3) многослойные (мультиламеллярные), насчитывающие до неск. десятков и даже сотен липидных бислоев (диаметр до 5000-10000 нм) (рис. 11).

Рис. 11. Липосомы могут быть однослойными (диаметр 20- 50 нм) и многослойными (5 -50 микрометров). Заштрихованные зоны – место нахождения воды, светлые – бимолекулярный липидный слой, «хвосты» составляющих его молекул обращены внутрь слоя.

Один из способов получения фермент-содержащих липосом заключается в том, что раствор липида в органическом растворителе впрыскивают с помощью микро-шприца в воду или водный солевой раствор при температуре, несколько превышающей точку кипения растворителя. После испарения растворителя в токе инертного газа происходит самопроизвольное образование (самосборка) бислойных пузырьков, липосом, содержащих включенный фермент.

В другом варианте раствор липида (например, лецитина) в органическом растворителе (например, в хлороформе) упаривается в вакууме. Липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят раствор фермента, встряхивают и выдерживают в течении некоторого времени. В полученной системе происходит самосборка мультиламеллярных липосом, содержащих включенный фермент. Для удаления невключившегося фермента липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе.

Моноламеллярные липосомы получают из мультиламеллярных ультразвуковой обработкой. Недостатком таких систем являются их недостаточная устойчивость, что сужает область их практического применения в медицине.

В последние годы применяют способ получения фермент-содержащих липосом путем включения ферментов в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи. После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированных молекул липидов, проводят полимеризацию липидных молекул (например путем облучения ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора). Образуются ковалентно сшитые замкнутые липидные бислойные мембраны. Полимерные липосомы обладают гораздо более высокой стабильностью по сравнению с обычными.

Липосомы часто применяются в биологии для изучения мембраноактивных белков и моделирования различных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы очень хорошо зарекомендовали себя в качестве модельной системы при изучении свойств биомембран. Липосомы позволяют воссоздавать элементы биологических структур непосредственно из материала биологических мембран. Было обнаружено, что отделенные от биомембран мембранные ферменты после включения в липосомы обнаруживают сходные со связанным на биомембране ферментом физические и каталитические свойства.