Спецпрактикум кафедры химической энзимологии (стр. 7 )

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Основная:

А. Ленинджер. Основы биохимии: В трех томах. (1985) Изд-во: М.: Мир. Серия Биотехнология, книга 1 «Проблемы и перспективы». Москва. Высшая школа. 1987. Серия Биотехнология, книга 7 «Иммобилизованные ферменты». Москва. Высшая школа. 1987. Жан-Мари Лен. Супрамолекулярная химия. Концепции и перспективы. Издательство: Наука, Новосибирск. 1998.

Дополнительная:

1.  Дж. В. Стид, Дж. Л. Этвуд. Супрамолекулярная химия (комплект из 2 книг). Академкнига. 2007.

2.  А. И. Гусев Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии. Физматлит. Москва. 2007 г.

3.  Ч. Пул-мл.,Ф. Оуэнс Нанотехнологии. 3-е издание Техносфера. Москва. 2007.

4.  , Ле Банг Шон, , . (1999) Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. Вопросы медицинской химии. Том 45 (1).

5.  , . (2001) Пегилированные лекарственные преапраты: современное состояние проблемы и перспективы (www. hepatit. ru).

6.  Nanotoday 2008. vol. 3 (3-4) p. 12-21 and 22-30.

7.  Niemeyer C., Mirkin C., Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives. Wiley, 2004.

8.  Goodsell D., Bionanotechnology: Lessons from Nature. Wiley-Liss, 2004.

9.  Reddy R. - Controlled - release, pegylated, liposomal formulations: new mechanisms in the delivery of injectable drugs. - Ann. Pharmacol. - 2000; М. 34. 915 – 923.

ЗАДАЧА 4

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ. СТАБИЛИЗАЦИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СИНТЕТИЧЕСКИХ МОЮЩИХ СРЕДСТВАХ.

А) при комплексообразовании с хитозаном;

Б) при инкапсулировании в системе альгинат-хитозан.

В настоящее время наблюдается значительный интерес к использованию ферментов класса гидролаз в синтетических моющих средствах (СМС). В первую очередь здесь речь идет о протеазах, целлюлазах, амилазах и липазах. Использование этих ферментов в моющих средствах позволяет эффективнее производить удаление загрязнений различной природы и повышает моющую активность традиционных моющих средств на 35-40%. Требования к ферментам при их использовании в качестве добавок к СМС определяются их активностью и стабильностью в присутствии других присутствующих в моющих средствах компонентов (окисляющих агентов, поверхностно-активных веществ), при повышенных температурах и щелочных значениях pH, оптимальных для процессов связанных с удалением загрязнений. Однако, недостаточная стабильность ферментов в условиях оптимальных для проведения удаления загрязнения является проблемой и ограничивает область применения фермент-содержащих СМС.

В данной практической задаче студентам предлагается: для стабилизации щелочной протеазы (одного из основных ферментов, применяемых в СМС) в условиях, моделирующих процесс стирки, применить метод (А) включения фермента в частицы, образованные на основе фермент-полиэлектролитного с природным полисахаридом, хитозаном или (Б) инкапсулирования фермента в системе альгинат-хитозан.

Альгинаты, соли альгиновой кислоты, широко используется для получения микро - и нанокапсул многих биоактивных молекул, ферментов, вакцин, инсулина и цитокинов. Альгинаты (соли альгиновых кислот) получают из бурых морских водорослей, они состоят из связанных 1.4-β- связями остатков D-маннуроновой (рКа=3.38) и β-L-гулуроновой (рКа=3.2) кислот. Альгинат образует гели с высокой степенью гидратации (высоким содержанием воды), высокой прочности, но относительно мягкой консистенции, что делает гидродинамические свойства геля близки по своим характеристикам к природным тканям. Гель на основе альгината образуется в мягких условиях при комнатной температуре без добавления органических растворителей, гель биодеградируем в физиологических условиях. Уникальные свойства альгината делают его одним из основных белковых носителей применяемым в биотехнологии и медицине.

Хитозан. Одним из наиболее распространенных и широко используемым аминополисахаридом является хитозан. Хитозан является деацилированным (частично или полностью) производным хитина, линейного полисахарида, построенного из остатков N – ацетил - b - D – глюкозамина с 1®4 – связями между ними (рис. 1).

Деацилированные производные хитина, хитозаны, существуют в природе, а также их получают путем химической обработки хитина. Молекулярная масса хитозана в зависимости от источника и способа выделения составляет 0.5 – 8*105 Да. Физико-химические свойства хитозана определяются молекулярным весом и степенью деацилирования. Данные факторы влияют на растворимость полисахарида, вязкость полученных растворов. Хитозан нерастворим в воде при нейтральных значениях рН, но растворяется в разбавленных органических кислотах, например в водном растворе уксусной кислоты с образованием солей, дающих высоковязкие растворы. Некоторые N – ацилпроизводные хитозана – хорошие гелеобразователи; при ацилирование хитозана производными дикарбоновых кислот получают поперечносшитые гели, удобные для иммобилизации ферментов систем. На примере ряда ферментов: липазы, целлюлазы, щелочной протеазы, L–аспарагиназы и др. было установлено, что в результате их иммобилизации на хитозане существенно увеличивается термостабильность ферментов и стабильность фермента в щелочной области значений рН. В ряде случаев наблюдается увеличение каталитической активности ферментов. Ферменты могут быть иммобилизованы на хитозане, используя как амино - так и гидроксильные группы, такую иммобилизацию называют “двойной иммобилизацией”. Сначала образуется связь между аминогруппой и глутаровым альдегидом, а затем между гидроксильной группой и карбодиимидом. “Двойная иммобилизация” приводит к дополнительной стабилизации фермента.

Важным свойством хитозана является его способность образовывать прочные нековалентные комплексы с белками, анионными полисахаридами, на чем основано его широкое применение в биотехнологии в качестве носителя для включения белков и живых клеток, а также при изготовлении медицинских препаратов.

Выполнение практической задачи

1) Приготовление стабилизированного препарата фермента

А) Включение щелочной протеазы в фермент-полиэлектролитный комплекс с хитозаном.

Препарат фермента растворяют в 0.02 М натрий-фосфатном буфере, рН 7.5.

Хитозан (молекулярно-массовое распределение 20–90 кДа) растворяют в смеси 2 % аскорбиновой кислоте и 2 % уксусной кислоте в концентрации 20 мг/мл. Затем полученный раствор хитозана разбавляют до нужной концентрации водой (финальное значение рН раствора 4.0-5.0).

Комплекс щелочной протеазы с хитозаном готовят путем постепенного добавления при перемешивании раствора хитозана к раствору фермента (весовое соотношение фермент/хитозан 4 : 1) при комнатной температуре (рН =6.0).

Б. Инкапсулирование щелочной фосфатазы в системе альгинат - хитозан.

Инкапсулирование фермента на альгиновых частицах проводят следующим образом: 0.02 г твердого измельченного карбоната кальция добавляют к 6 мл 1.5% (вес/об.) водному раствору альгината натрия и помещают на обработку ультразвуком на 4 мин. Суспензию диспергируют в 30 мл октана, содержащего 1.5% (вес/вес) SPAN 80 и 0.2 % уксусной кислоты при перемешивании (760 rpm) при комнатной температуре в течении 5 мин. К полученной эмульсии добавляют 120 мл воды. Продолжают перемешивать в течении 40 мин при скорости перемешивания 300 rpm. Полученные частицы альгината кальция промывают 200 мл 1% (об.) раствором Tween 80 в воде и затем промывают 3 раза 100 мл воды для удаления остатков масла с поверхности частиц. Для инкапсулирования фермента 0.5 мл частиц альгината кальция (сухой вес 4 мг) добавляют к 0.5 мл 0.2 мг/мл раствору фермента в 0.2 М натрий-фосфатном буфере, рН 6-7. Адсорбция протекает в течении 30 мин при 4оС.

Покрытие хитозановой оболочкой: полученные частицы, содержащие фермент, инкубируют в 1% растворе хитозана в течении 10 мин при деликатном перемешивании.

После окончания синтеза частицы центрифугируют и промывают 15 мл воды 5 раз для удаления несвязанного фермента.

2. Определение каталитической активности ферментного препарата, содержащего щелочную протеазу (субтилизин) по азо-казеину. В типичном эксперименте реакционную смесь, содержащую 0.03 М Трис-HCl, pH 9, 1мМ CaCl2 и 1% азоказеин, инкубируют 5 минут при 60оС. Реакцию инициировуют добавлением раствора фермента, после чего реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при 60оС (или другой исследуемой температуре). Реакцию останавливают добавлением раствора TХУ (финальная концентрация в системе 5%). Смесь центрифугируют 10 мин при 12000–13000 об/мин. Измеряют поглощение реакционной смеси при 450 нм относительно раствора сравнения, не содержащего фермент.

Исходная концентрация ферментного препарата составляла 5-10 мг/мл. Для измерения каталитической активности исходный ферментный препарат предварительно разбавляли буферным раствором, 0.03 М Трис-HCl, pH 9.0. После чего проверяют финальное значение рН раствора. Разбавление анализируемого ферментного препарата щелочной протеиназы подбирают так, чтобы при измерении каталитической активности полученные значения оптического поглощения при 450 нм находились в пределах линейных участков калибровочной кривой, полученной в отдельном эксперименте.

За 1 ед. активности препарата щелочной протеиназы принимали количество фермента необходимое для увеличения оптической плотности раствора на длине волны 450 нм на одну единицу в реакции гидролиза азоказеина в стандартных условиях за 10 мин при 60оС.

3. Исследование термостабильности ферментных препаратов щелочной протеазы в составе нанокомплекса с хитозаном в сравнении со свободным ферментом.

Термостабильность ферментных препаратов определяют путем измерения зависимостей остаточной активности (А) ферментных препаратов от времени инкубации при температуре 60оС и рН 9.0 (условия, моделирующие процесс стирки). Исходный ферментный препарат (стабилизированный или нативный) предварительно разбавляли буферным раствором, 0.03 М Трис-HCl, pH 9.0, как делали перед измерением активности. После чего проверяют финальное значение рН раствора. Образцы ферментных препаратов термостатируют при 60оС в течение 60 минут. Через определенные промежутки времени 0, 5, 10, 30, 40 и 60 минут отбирают пробы (по 0.2 мл), охлаждают под сильной струей холодной воды и после 20 минут инкубации при комнатной температуре измеряют остаточную каталитическую активность ферментов в соответствии с методикой измерения каталитической активности щелочной протеазы (см. п. 2).

4. Обработка кинетических кривых термоинактивации. Определение остаточной активности и констант инактивации свободного фермента и фермента в составе нанокомплекса с хитозаном

В качестве характеристик термостабильности препарата фермента используется уровень остаточной активности фермента после 60 минутной инкубации при заданных условиях, а также значение константы скорости термоинактивации, kin.

Строят зависимости:

1. Активность (А) от времени (остаточная активность) и сравнивают уровень остаточной активности после 60 минут инкубации для свободного фермента и фермента в составе комплекса с хитозаном.

2. Относительная активность А/А0 от времени, где А0 активность соответствующего препарата фермента до инкубирования.

3. В полулогарифмических координатах строят зависимость относительной активности А/А0 от времени. Делают выводы о порядке константы термоинактивации в случае свободного фермента и фермента в комплексе с хитозаном. Определяют константы инактивации первого порядка.

Сравнивают стабильность фермента в составе комплекса и свободного фермента. Делают вывод.