Спецпрактикум кафедры химической энзимологии (стр. 6 )

Рис. 19. Основные способы регуляции параметров системы обращенных мицелл. 1 - увеличение содержания воды при [ПАВ]=const: размеры мицелл растут, их число уменьшается; 2 – увеличение в одинаковой пропорции концентрации воды и [ПАВ]: размеры мицелл остаются неизменными, их число увеличивается; 3 – увеличение концентрации ПАВ при постоянной концентрации воды: размер мицелл уменьшается, их число растет.

Мицеллярный подход является в настоящее время классическим методом контроля олигомерного состава ферментов. Применение обращенных мицелл позволяет целенаправленным подбором размера мицеллярной матрицы (при варьировании степени гидратации системы) формировать желаемую надмолекулярную форму белка. Обращенные мицеллы можно рассматривать как своеобразный «наноконтейнер», позволяющий проводить как ассоциацию, так и диссоциацию белковых комплексов, получать надмолекулярные белковые структуры не реализующиеся в водных растворах. С точки зрения практического применения перспективным направлением является управляемая диссоциация «тел включения» и сворачивание ферментов в системе обращенных мицелл ПАВ. Проблема сворачивания рекомбинантных белков на сегодняшний день остается нерешенной для многих случаев. Особенно, эта проблема проявляется в случае больших, мульти-доменных и гидрофобных ферментов. Особенностью мицеллярного подхода является возможность изолировать молекулу фермента в отдельной мицелле, что с одной стороны, усиливает эффективность процесса сворачивания (подобно действию молекулярных шаперонов), а с другой стороны, защищает фермент от межмолекулярного взаимодействия, образования межмолекулярных S-S-связей и агрегации белка в процессе рефолдинга.

Образование конъюгатов биологически активных молекул с молекулями полиэтиленгликоля (ПЭГ). Применяется для стабилизации белок-содержащих лекарственных средств, увеличения времени циркуляции лекарств, транспорт лекарств, уменьшение иммунного ответа на введение чужеродных белков. 

Лекарственные препараты белковой или пептидной структуры (интерфероны, гормоны, факторы роста, цитокины, тромболитики) все больше применяются в медицине. Как уже отмечалось, лечение нативными препаратами белковой природы имеет ряд существенных недостатков: белки быстро гидролизуются в гастроинтестинальном отделе пищеварительного тракта и поэтому используются, как правило, парентерально. Относительно короткий период "естественной" полужизни таких препаратов в организме пациента предусматривает их многократное использование для достижения требуемого терапевтического воздействия. Еще одним важным негативным фактором, ограничивающим применение нативных или рекомбинантных белковых препаратов, является их высокая иммуногенность и связанные с ней сенситивные реакции.

Одним из путей повышения эффективности лекарственных препаратов белковой структуры является "пегилирование" - химическая модификация белков полиспиртами, полиэтиленгликолем (ПЭГ) и блоксополимерами (пролиэтилен - и полипропиленгликоля), плюрониками и проксанолами. полиэтиленгликолем (ПЭГ). Подобная химическая модификация фармакологических препаратов белковой природы направлена на улучшение их переносимости, снижение иммуногенности, повышение периода их полужизни.

В настоящее время ПЭГ одобрен Управлением по питанию и лекарственным препаратам США (FDA) в качестве субстанции, разрешенной к использованию в медицине (производство лекарственных препаратов), продуктах питания и косметологии.

Для пегилирования белков применяется метод образования нековалентных аддуктов, образующихся в условиях инкубирования смеси белка и ПЭГ в условиях повышенного давления, а также ковалентная модификация по аминогруппам белка. При этом удобно использовать моноальдегидные производные полиспиртов, например:

ПЭГ (1) - СН3(ОСН2СН2)44ОСН2СНО;

ПЭГ (2) - СН3(ОСН2СН2)16ОСН2СНО;

Проксанол (1) - С4Н9[OCH(CH3)CH2]14(OCH2CH2)20OCH2CHO;

Проксанол (2) - С4Н9(OCH2CH2)20[OCH(CH3)CH2]14OCH(CH3)CHO.

Молекулы ПЭГ могут иметь различную молекулярную массу и стереохимическую структуру. Молекулярный вес молекул ПЭГ может колебаться в пределах 300 - 4000 Дальтон, а выстроенные в цепи макромолекулы ПЭГ могут формировать как разветвленную, так и линейную стереохимию. Именно масса ПЭГ и его стереохимическая структура, как правило, определяют принципиальные свойства будущего модифицированого белкового субстрата. В основном более длинные цепи ПЭГ обуславливают большую продолжительность периода полужизни коньюгата "ПЭГ - пептид" и его фармакологическую стабильность. Другим важным фактором, влияющим на фармакодинамику и фармакокинетику ПЭГ - модифицированных белков, является структура ПЭГ - цепочек: разветвленная молекула ПЭГ формирует замедление активного метаболизма препарата, что также влечет за собой удлинение времени активной циркуляции препарата. С разветвленной структурой цепочек ПЭГ связана также и значительно меньшая иммуногенность модифицированных препаратов при сохранении их основных фармакологических свойств. Подобные эффекты могут быть достигнуты и другим путем - связыванием пептида, например, не одной, а несколькими молекулами ПЭГ, имеющими при этом линейную структуру цепочек. Хорошо изученным примером в этой связи является молекула интерлейкина - 2 (ИЛ - 2). Так как молекула ИЛ - 2 очень мала, последняя свободно фильтруется через почки и имеет очень короткий период полужизни. Соединение ИЛ - 2 с ПЭГ, имеющей молекулярную массу менее 20 kDa, практически никак не влияет на фармакодинамику белка, но повышение молекулярной массы ПЭГ до 60 - 70 кДа уже значительно замедляет фильтрацию коньюгата "ПЭГ - ИЛ - 2" и увеличивает его время полужизни и биологическую доступность.

Одно из важнейших свойств модифицированных ПЭГ - молекул - высокая гидрофильность, формирующая принципиально новые физико-химические свойства модифицированного белка. При модификации белка молекулами ПЭГ происходит формирование "водного облака" вокруг модифицированной молекулы "ПЭГ - белок", за счет чего значительно повышается гидродинамический радиус коньюгата. Этот своеобразный "щит" воды вокруг модифицированной молекулы белка с одной стороны значительно повышает растворимость и биодоступность препарата, с другой - защищает молекулу от других белков (нейтрализующие антитела, комплемент). Таким образом ПЭГ - модифицированные пептиды значительно более защищены от опсонизации (взаимодействия с белками плазмы – опсонинами, которые "метят" чужеродные компоненты, делают их мишенями для клеток ретикулоэндотелиальной системы РЭС) и активного фагоцитоза клеточных структур макроорганизма.

ПЭГ - модификация белковых препаратов, привнесла серьезные изменения в результаты лечения при таких заболеваниях, как ферментные дефициты, лейкемия, хронические воспалительные заболевания, онкология, хронические вирусные инфекции, кардиоваскулярная патология. Например Пегинтерферон альфа-2b применяется в противовирусной терапии, индуцирует подавление репликации вирусных ДНК или РНК, что и определило его широкое применение при лечении хронических вирусных гепатитов B и С. Данный препарат уже прошел все необходимые клинические испытания и зарегистрирован к применению во всех ведущих европейских странах (в том числе и России) и США под коммерческим названием ПегИнтрон. На рисунке 2. представлены профили фармакокинетики двух препаратов: нативного интерферна альфа-2b (Б) и пегилированного его коньюгата ПегИнтрона (А). Очевидно, что ПегИнтрон имеет значительно лучший биологический профиль, по сравнению со стандартным интерфероном альфа-2b; это выражается значительным повышением периода полужизни пегилированого аналога, снижением его иммуногенных свойств. Период "эффективной" полужизни препарата составляет в среднем около 40 часов! Для ПэгИнтрона характерен баланс между противовирусной активностью и длительным периодом полувыведения, позволяющим назначать препарат один раз в неделю, а также эффективно выводить метаболиты ПЭГ из организма.

А

Б

10 20 30 40 50 60 70 80 Время, часы

Рис. 19. Фармакокинетический профиль стандартного (Б) и пегилированного интерферона альфа-2b (А) (Из обзора , . 2001. Пегилированные лекарственные преапраты: современное состояние проблемы и перспективы. (www. hepatit. ru))

Таким образом, пегилирование лекарственных препаратов пептидной структуры имеет ряд весомых и несомненных преимуществ, которые ранее были просто невозможны при использовании нативных аналогов: усиление биологической активности, удлинение периода "эффективной" полужизни, замедление выведения, понижение токсичности и иммуногенности. К основным недостаткам ПЭГ - коньюгированных пептидов, используемых и в качестве уже разрешенных лекарственных форм, и в продолжающихся клинических испытаниях, можно отнести: возможное уменьшение активности белка, связанное с выбором "неправильного" размера или структуры ПЭГ; с этой же причиной может быть связано и возможное удлинение элиминации пептида. Так или иначе, полученные результаты уже проведенных и продолжающихся клинических испытаний с ПЭГ - модифицированными препаратами белковой структуры, а также экспериментальные данные свидетельствуют о явном преимуществе коньюгированных аналогов по сравнению с нативными белками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, одним из основных направлений исследований в медицинской биотехнологии является создание функциональных или многофункциональных систем, включающих в свой состав биологически активных вещества. При этом, в первую очередь, ставятся задачи направленной доставки лекарств, создания новых противоопухолевых и антиоксидантных соединений. Рассматриваются направления создания магнитноуправляемых частич, обладающих термочувствительностью. Развитие медицинской биотехнологии в перспективе способно привести к новому уровню понимания биологических процессов и созданию принципиально новых средств диагностики, профилактики и лечения многих заболеваний.