Моделирование тотальной ишемии головного мозга Функциональные тесты и биохимические маркеры (стр. 2 )

Под сонную артерию с помощью пинцета подвести и наложить две лигатуры. Наложить лигатуры на обе общие сонные артерии как показано на рисунке 1. Это приведет к прекращению кровоснабжения головного мозга. Ушить рану послойно с соблюдением правил асептики и антисептики. Все манипуляции необходимо проводить на термостатируемом операционном столике при температуре 37°C.

В качестве параметров оценки ишемического поражения головного мозга служит тест на выживаемость животных. Для анализа выживаемости животных в ходе моделирования глобальной ишемии головного мозга провести аналогично ложную операцию, т. е. без наложения лигатур.

Рисунок 1. Схематическое изображение артериального сосудов для проведения моделирования ишемии (http://jim. hutchins. name/research_skills. html)

Полученные результаты занести в таблицу:

Количество выживших животных в группе/Группа	Интактные животные	Ложно-оперированные животные	Модель тотальной ишемии ГМ
1-е сутки
7-е сутки
14-е сутки
21-е сутки

Вопросы:

1.  Что такое ишемическое повреждение головного мозга?

2.  Что такое экспериментальное моделирование, его связь с фундаментальной и практической наукой.

3.  Назовите основные этапы моделирования тотальной ишемии.

Лабораторная работа №2

«Создание реперфузионной модели ишемического повреждения»

Перед окклюзией провести наркотизацию, кожный разрез и выделение артерий согласно протоколу Лабораторной работы №1.

Для создания реперфузионной модели ишемического повреждения под каждую общую сонную артерию подвести две лигатуры, наложить две лигатуры – выше и ниже уровня наложения микрохирургических зажимов. Наложить зажимы на обе общие сонные артерии. Выдержать 60 минут, после чего убрать зажимы для восстановления кровотока. В послеоперационном периоде до момента выхода из наркоза поддерживать температуру тела животных на постоянном уровне за счет внешнего источника тепла.

Зафиксировать количество выживших животных в зависимости от времени наступления реперфузии. Данные занести в таблицу:

Количество выживших животных в группе/Группа	Интактные животные	Ложно-оперированные животные	Модель тотальной ишемии ГМ с реперфузией
1-е сутки
7-е сутки
14-е сутки
21-е сутки

Вопросы:

1. Что такое реперфузия сосудов головного мозга?

2. Какие последствия реперфузии сосудов головного мозга вам известны?

ТЕМА №2

«Функциональные тесты для оценки состояния нервной системы»

Реализация экспериментальных моделей клинических форм ишемии, приводит к снижению функционирования отдельных областей мозга. Как правило, формируется когнитивный дефицит, выражающийся в снижении обучения и памяти. Однако, ни один из существующих на сегодняшний день методических подходов при изолированном применении, не может дать исчерпывающий ответ о состоянии животного или эффективности нового препарата. Целесообразно при разработке дизайна эксперимента использовать несколько методик, с тем, чтобы по возможности максимально полно оценить состояние животного.

В качестве параметров эффективной оценки функционирования головного мозга являются показатели неврологического дефицита животных и тестирование в поведенческих тестах.

Лабораторная работа №3

«Определение неврологического статуса животных»

Определение неврологического статуса проводится по общепринятой шкале оценки выраженности неврологического дефицита (Neurological Severity Scores – NSS) в модификации для крыс (таблица 1.2). Данный тест оценивает способность животного выполнить 10 различных задач, которые оценивают базовые рефлексы, а также способность к движению и сохранению равновесия. Один балл присваивается за невыполнение задачи, таким образом, нормальное здоровое животное должно иметь 0 баллов по всем пунктам шкалы. Оценку неврологического дефицита животных проводят на 1-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после моделирующих воздействий.

Перед проведением тестов животное извлечь из клетки и поместить на ровную поверхность. При выполнении задач по движению и удержанию на перекладинах расположить перекладины устойчиво на высоте 40-50 см над мягкой поверхностью, поместить животное в центр перекладины как показано на рисунке 2.

Рисунок 2. Оценка неврологического статуса крыс

Таблица 1

Шкала выраженности неврологического дефицита (Neurological Severity Scores - NSS) для крыс

Задача	Описание	NSS
Выход из круга	Способность и инициатива выйти из круга диаметром 60 см за 3 мин	1
Моно-/Гемипарезы	Парезы передней и задней конечностей с противоположной стороны	1
Движение в прямом направлении	Способность сохранять направленное движение	1
Рефлекс вздрагивания	Безусловный рефлекс; подпрыгивание крысы в ответ на громкий хлопок руками	1
Поисковое поведение	Безусловный ориентировочно-исследовательский рефлекс (рефлекс на новизну)	1
Балансирование на перекладине	Способность удержаться на перекладине шириной 15 мм в течение 10 с	1
Балансирование на круглом стержне	Способность удержаться на круглом стержне диаметром 10 мм в течение 10 с	1
Движение вдоль перекладины: 6 см	Способность двигаться вдоль 30 см перекладины шириной 6 см	1
Движение вдоль перекладины: 4 см	Способность двигаться вдоль 30 см перекладины шириной 4 см (усложнение задания)	1
Движение вдоль перекладины: 2 см	Способность двигаться вдоль 30 см перекладины шириной 2 см (усложнение задания)	1
Максимальное количество баллов		10

Интерпретация результатов:

·  от 7 до 10 баллов – выраженное повреждение ЦНС;

·  от 4 до 6 баллов – умеренное повреждение ЦНС;

·  от 1 до 3 баллов легкое повреждение ЦНС.

Тяжесть неврологического дефицита в исследуемых группах выразить в виде среднего значения и ошибки среднего (М ± SEM). Полученные результаты занести в таблицу:

Сроки исследования	Интактные	Ложно оперированные животные	Ишемия (0,9% раствор NaCl)
1-е сутки
7-е сутки
14-е сутки
21-е сутки

Вопросы:

1. Что такое неврологический статус и неврологический дефицит?

2. Перечислите основные задачи, используемые экспериментатором для оценки неврологического статуса животного.

Лабораторная работа №4

Тест «Открытое поле»

Тестирование общей двигательной активности, ориентировочно-исследовательской активности, эмоционального состояния животных проводят в установке «открытое поле» (Open Field LE800S, PanLab/Harvard Apparatus, Испания) до моделирования ишемии и через 10 дней после операции.

Рисунок 3. Тестирование поведения крысы в тесте «открытое поле»

Тест заключается в количественном измерении компонентов поведения животного, помещенного в новое открытое пространство (арену), выбраться из которого ему мешает огораживающая арену стенка. Установка «открытое поле» для крыс представляет собой квадратную арену серого цвета (90 см x 90 см) с высотой стенок 40 cм. Видеорегистрация отдельных поведенческих реакций животных осуществляется с помощью видеокамеры Sony SSC-G118 (Япония). На рисунке 3 показана регистрация и анализ данных, которые контролируются программой Smart v.3.0.03. (Panlab Harvard Apparatus Испания; Stoelting, США). Освещенность площадки во время опыта должна составлять 200 Лк. Клетку с животными за 60 мин до начала теста необходимо перенести из жилой комнаты в тихое, слабо освещенное помещение. Непосредственно перед выполнением теста аккуратно перенести животное в поведенческую и поместить в центр поля.

С целью определения ориентировочно-исследовательской и двигательной активности крыс в течение 5 мин тестирования регистрируют следующие показатели:

Горизонтальная двигательная активность (ГДА), отражающая общую двигательную активность крыс (пройденное расстояние, см). Данный параметр включает пробежки по разным траекториям, вплоть до кружения вокруг одного места. Основным критерием для идентификации данной формы поведения является участие в перемещении животного всех четырех лап.

Вертикальная двигательная активность (ВДА), отражающая ориентировочно-исследовательское поведение животных (количество стоек). Фиксируются вертикальные стойки, как с опорой, так и без опоры на борт арены.