Моделирование тотальной ишемии головного мозга Функциональные тесты и биохимические маркеры (стр. 4 )

Определение концентрации молочной кислоты (лактат)

Принцип метода:

Лактат в присутствии НАД+ под действием ЛДГ окисляется в пируват, при этом образуется эквимолярное количество НАДН. Связывание образующегося в ходе реакции пирувата гидразин-глициновым буфером способствует полному окислению лактата:

Лактат + НАД+ + гидразин → гидразон-пируват + НАДН +Н+ + Н2О

Образование восстановленной формы НАДН, эквимолярное количеству окисленного лактата, регистрируется спектрофотометрически при длине волны равной 340 нм.

Ход определения:

Для определения лактата в пробирки наливают 2,75 мл глицин-гидразинового буфера (0,4 М гидразин, 1 М глицин, рН = 9,5), затем 0,1 мл тканевого экстракта и 0,1 мл 5*10-2 НАД+. Определяют оптическую плотность (λ = 340 нм) полученных растворов Е1. После этого в кюветы к пробам добавляют 0,1 мл ЛДГ (5Е белка/мл). Через 20 мин повторно определяют оптическую плотность (Е2.).

Расчет концентрации:

Концентрацию лактата рассчитывали по формулам:

Mлак = ∆E* V * K/6,22;K = (mo + 3,3)*(m3-m1)/mo-(m2-m1); где

М – концентрация субстрата в мкмоль/г влажной ткани;

∆E – разница экстинкции от начала и до полного окончания реакции Е1 – Е2;

V – объём пробы, мл;

6,22 – коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиннуклеотидов;

К – коэффициент разведения по отношению к 1 г ткани;

mo – объём ткани для анализа,

m1 – масса стеклянной пробирки,

m2 – масса пробирки с фильтратом,

m3 – масса пробирки после нейтрализации.

Лабораторная работа №7

«Определения содержания нейротрофического фактора (BDNF) методом твердофазного иммуноферментного анализа»

Подготовка образцов:

Кровь с антикоагулянтом (гепарин) центрифугировать 15 мин при 200 g. Отобрать плазму, использовать для исследования (либо гомогенат головного мозга 1 г ткани на 10 мл физиологического раствора).

Разведение промывочного буфера: развести флакон с концентратом буфера в 500 мл деионизированной воды.

Разведение стандартов: развести BDNF – стандарт в 2 мл раствора для разведения стандартов. Двукратными последовательными разведениями приготовить 7 калибраторов в концентрациях: 4000 пг/мл, 2000 пг/мл, 1000 пг/мл, 500 пг/мл, 250 пг/мл, 125 пг/мл, 62.5 пг/мл, 0 пг/мл.

Подготовить образцы, реагенты и стандарты для анализа.

Ход определения:

1.  Поместить в рамку иммунологического планшета необходимое количество стрипов – калибровочные пробы и исследуемые образцы в 2 повторах.

2.  Внести 100 мкл раствора для разведения плазмы (Assay Diluent RD1S) в каждую лунку.

3.  Внести в соответствующие лунки в дубликатах по 50 мкл каждой калибровочной пробы и исследуемых образцов (разведение 1:10). Одну лунку оставить пустую – Blanк. Внесение калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых образцов необходимо произвести в течение  5–10 мин.

4.  Заклеить планшет и инкубировать 120 мин при 18 – 25 °С.

5.  По окончании инкубации снять липкую пленку, планшет не промывать!

6.  Добавить в каждую лунку по 100 мкл белоксвязующего агента

(BDNF – conjugate).

7.  Заклеить планшет и инкубировать 60 мин при 18 – 25 оС.

8.  Снять липкую пленку по окончании инкубации и поместить ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. С помощью промывочного устройства промыть лунки планшета 5 раз промывочным раствором (Wash Buffer). В каждую лунку вносить по 200 мкл жидкости в процессе каждого цикла промывки. Необходимо добиться полного опорожнения лунок после каждого их заполнения. По окончании промывки остатки влаги тщательно удалить, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

9.  Внести во все лунки по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина. Внесение раствора субстрата тетраметилбензидина в лунки необходимо произвести в течение 2 – 3 мин. Инкубируйте планшет в течение 10 – 20 минут в зависимости от степени развития синего окрашивания. Инкубировать в темноте.

10.  Внести во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата тетраметилбензидина, по 50 мкл стоп-реагента, перемешать, при этом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.

11.  Измерить величину оптической плотности (ОП) содержимого лунок планшета на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Измерение ОП содержимого лунок планшета необходимо произвести в течение 5 мин после внесения стоп-реагента.

12.  Построить график зависимости оптической плотности от концентрации BDNF в калибровочном растворе. По калибровочному графику определяем концентрацию BDNF в образцах.

Лабораторная работа №8

«Определение нейрон-специфической енолазы (NSE) методом твердофазного иммуноферментного анализа»

Подготовка образцов:

Кровь с антикоагулянтом (гепарин) открутить 15 мин при 200 g, в течение 30 мин после сбора. Отобрать плазму, использовать для исследования (или гомогенат ткани головного мозга).

Разведение промывочного буфера (Wash Buffer): развести флакон с концентратом буфера в 500 мл деионизированной воды.

Разведение стандартов: развести – стандарт в 2 мл раствора для разведения стандартов. Двукратными последовательными разведениями приготовить 7 калибраторов в концентрациях 40 нг/мл, 20 пг/мл, 10 пг/мл, 250 пг/мл, 5 пг/мл, 2,5 пг/мл, 1,25 пг/мл, 0 пг/мл.

Подготовить образцы, реагенты и стандарты для анализа.

Ход определения:

1.  Поместить в рамку необходимое количество стрипов - исследуемые образцы в 2 повторах и 16 лунок для калибровочных проб.

2.  Промыть лунки планшета с помощью промывочного устройства

5 раз промывочным раствором (Wash Buffer). По окончании промывки остатки влаги тщательно удалить, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

3.  Внести в соответствующие лунки в дублях по 100 мкл каждой калибровочной пробы (40 пг/мл разбавляем 1:1 последняя лунка содержит 0 пг/мл) и исследуемых образцов. Одну лунку оставить пустую Blanк. Внесение калибровочных проб, исследуемых образцов необходимо произвести в течение 5-10 мин.

4.  Заклеить планшет липкой пленкой и инкубировать 120 мин при 37 °С.

5.  По окончании инкубации снять липкую пленку и поместить ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. Планшет не промывать.

6.  Внести во все лунки по 100 мкл раствора Biotin-antibody в рабочем разведении.

7.  Заклеить планшет липкой пленкой и инкубировать 60 мин при 37 °C.

8.  Снять липкую пленку по окончании инкубации и поместить ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. С помощью промывочного устройства промыть лунки планшета 5 раз промывочным раствором (Wash Buffer). В каждую лунку вносить не менее 350 мкл жидкости в процессе каждого цикла промывки. Необходимо добиться полного опорожнения лунок после каждого их заполнения. По окончании промывки остатки влаги тщательно удалить, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

9.  Внести во все лунки по 100 мкл раствора HRP-avidin в каждую лунку.

10.  Заклеить планшет липкой пленкой и инкубировать 60 мин при 37 °C.

Снять липкую пленку по окончании инкубации и поместить ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. С помощью промывочного устройства промыть

11.  Снять липкую пленку по окончании инкубации и поместить ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. С помощью промывочного устройства промыть лунки планшета 5 раз промывочным раствором (Wash Buffer). В каждую лунку вносить не менее 350 мкл жидкости в процессе каждого цикла промывки.

12.  Внести во все лунки по 90 мкл раствора субстрата тетраметилбензи-дина. Внесение раствора субстрата тетраметилбензидина в лунки необходимо произвести в течение 2 – 3 мин. Инкубировать планшет в темноте при 37 °С в течение 15 – 30 мин в зависимости от степени развития синего окрашивания.

13.  Внести во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата тетраметилбензидина, по 50 мкл стоп-реагента, при этом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.

14.  Измерить величину оптической плотности содержимого лунок планшета на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Построить график зависимости оптической плотности от концентрации NSE в калибровочном растворе. По калибровочному графику определяем концентрацию NSE в образцах.

Заключение

Таким образом, модель тотальной ишемии головного мозга крыс позволяет моделировать патологию, наблюдаемую в клинической практике при остановке сердца, при асфиксии, при хирургических операциях с применением искусственного кровообращения, при проведении хирургических вмешательств на крупных сосудах. Модель ишемического повреждения может использоваться при изучении патофизиологических механизмов глобальной ишемии головного мозга, определении зоны и структуры головного мозга, подвергающиеся наибольшему повреждению при глобальной ишемии, зоны гипоперфузии, формирующиеся при восстановлении кровотока после периода глобальной ишемии головного мозга. Модель позволяет раскрыть механизмы экзогенной (фармакологической) и эндогенной нейропротекции.

Литература

1.  етодики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. – М.: Высшая школа, 1991. – 399 с.

2.  , Скворцова головного мозга. – М.: Медицина, 2001. – 328 с:

3.  Кадыков сосудистые заболевания головного мозга. –М.: ГЭОТАР–Медиа, 2006. – 221 с.

4.  Костинский модели ишемического повреждения головного мозга // Украинский неврологический журнал. – 2009. – № 3. – С.77-84.

5.  Патофизиология // под ред. , Е. Д, Гольдберга. – Томск: Томский ун-т, 2001. 206 с.

6.  Сонин Д. Л., Петрищев Н. Н., Тюкавин А. И., Ивкин  модели венозного тромбоза на мелких лабораторных животных. // Региональное кровообращение и микроциркуляция. – 2014. – №. 2. – С.22–34.

7.  , , Макаров модели когнитивных нарушений // Международный вестник ветеринарии. – 2016.– № 1. – С.105–116.

8.  Ginsberg M. D. New strategies to prevent neural damage from ischemic stroke // New York. – 1994. P. 1–34.

9.  Hall C. S.. Emotional behavior in the rat. III. The relationship between emotionality and ambulatory activity // p. physiol. Psychol. – 1936. – № 22. – P.345–352.

10.  Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia // Brain Res. –1982. – № 000. – P. 57–69.

11.  Levy D. E., Brierley J. munications between vertebrobasilar and carotid arterial circulations in the gerbil // Exp. Neurol. – 1974. – № 45. – P. 503 –508.

12.  Oron A., Oron U., Streeter J., De Taboada L., Alexandrovich A., Trembovler V., Shohami E. Low-Level Laser Therapy Applied Transcranially to Mice following Traumatic Brain Injury Significantly Reduces Long-Term Neurological Deficits // Journal Of Neurotrauma. – 2007. – №.4. – P.651–659.

13.  Sugawara T., Kawase M., Lewen A., Noshita N., Gasche Y., Fuji-mura M., and Chan, P. H. Effect of hypotension severity on hippo-campal CA1 neurons in a rat global ischemia model // Brain Res. – 2000.– № 000. – Р. 281 – 287.

14.   [Электронный ресурс]. Режим доступа http://jim. hutchins. name/research_skills. html

15.   Bergmeyer, H. U. Methods of Enzymatic Analysis / H. U. Bergmeyer // Academic Press. – 1974. - V.4. – Р. 2066-2072.

16.   Academic Press. – 1974. - V.4. – Р. 2066-2072.

МОДЕЛИРОВАНИЕ ТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Функциональные тесты и биохимические маркеры

Авторы:

Наталья Александровна Щелчкова

Ирина Игоревна Белоусова

Роман Дмитриевич Лапшин и др.

Учебно-методическое пособие

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. ».

603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

Подписано в печать. Формат 60х84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Таймс.

Усл. печ. л. . Уч.-изд. л.

Заказ № . Тираж 30 экз.

Отпечатано в типографии Нижегородского госуниверситета им.

603600,