Моделирование тотальной ишемии головного мозга Функциональные тесты и биохимические маркеры (стр. 1 )

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Национальный исследовательский

Нижегородский государственный университет им. 

МОДЕЛИРОВАНИЕ ТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Функциональные тесты и биохимические маркеры

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано методической комиссией Института биологии и биомедицины для студентов ННГУ, обучающихся по направлению 06.03.01 «Биология», профиль «Нейробиология», профиль «Биомедицина»

Нижний Новгород

2016

УДК 577.2(075.8)

ББК Е072я73

М74

М74 МОДЕЛИРОВАНИЕ ТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ. Авторы: , , : Учебно-методическое пособие. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2016. – 26 с.

Рецензент: д. б.н.

В пособии рассмотрены базовые понятия по моделированию тотальной ишемии, физиологическим тестам и биохимическим маркерам с позиций комплексного подхода при изучении и применении их для понимания процессов, происходящих в организме при сосудистых патологиях головного мозга.

Учебно-методическое пособие подготовлено в строгом соответствии с учебными планами дисциплин «Техника проведения эксперимента», «Нейрохимия», «Основы биофизики и физиологии возбудимых систем», «Филогения нервной системы» и предназначено для студентов 3 и 4 курса ННГУ, обучающихся по направлению 06.03.01 «Биология», профиль «Нейроби-ология», профиль «Биомедицина».

Ответственный за выпуск:

председатель методической комиссии Института биологии и биомедицины ННГУ, к. б.н.

УДК 577.2(075.8)

ББК Е072я73

© Нижегородский государственный

университет им. , 2016

Содержание

Введение………………………………………………………………………….	4
Список сокращений……………………………………………………………...	4
ТЕМА №1. Ишемическое поражение головного мозга……………………….	5
Лабораторная работа №1. Моделирование глобальной ишемии головного мозга крысы…………………………………………………………..	7
Лабораторная работа №2. Создание реперфузионной модели ишемического повреждения…………………………………………………….	9
ТЕМА №2. Функциональные тесты для оценки состояния нервной системы…………………………………………………………………	10
Лабораторная работа №3. Определение неврологического статуса животных………………………………………………………………...	10
Лабораторная работа №4. Тест «Открытое поле»……………………………..	13
Лабораторная работа №5. Тест «Водный лабиринт Морриса»……………….	15
ТЕМА №3. Биохимические маркеры ишемического повреждения…………...........................................................................................	17
Лабораторная работа №6. Оценка тканевой гипоксии по соотношению лактат/пируват в ткани головного мозга…………………..	17
Лабораторная работа №7. Определения содержания нейротрофического фактора (BDNF) методом твердофазного иммуноферментного анализа……………………………………………………	19
Лабораторная работа №8. Определение нейрон-специфической енолазы (NSE) методом твердофазного иммуноферментного анализа………	21
Заключение……………………………………………………………………….	22
Литература………………………………………………………………………..	23

Введение

Учебно-методическое пособие содержит краткие теоретические сведения по моделированию тотальной ишемии, физиологическим тестам и биохимическим маркерам, применяемых в современной аналитической практике прикладных и фундаментальных отраслей биомедицины.

Основная цель авторов учебно-методического пособия – помочь студентам освоить принципы экспериментального ишемического повреждения головного мозга у животных, научить трактовать результаты функциональных показателей и биохимических маркеров.

Моделирование ишемии головного мозга на животных является важным экспериментальным методом нейрохирургических исследований, поскольку позволяет изучать патогенез цереброваскулярных расстройств, обосновать новые терапевтические стратегии, оценить безопасность и клиническую эффективность разработанных приемов лечения.

Изучение острого нарушения мозгового кровообращения является актуальной задачей медицины, так как эта проблема представляет собой одну из основных причин заболеваемости, смертности, длительной нетрудоспособности и инвалидности в обществе.

Список сокращений

NT3 – нейротфин 3

NT4 – нейротрофин 4

КК – креатинкиназа

ОП – оптическая плотность

ЛДГ – лактатдегидрогеназа

NGF – фактор роста нервов

ИФА – иммуноферментный анализ

BDNF – нейрональный трофический фактор

НАДН – никотинамид-аденин-динуклеотид

НСЕ (Neuron-specific Enolase) – нейрон-специфическая енолаза

ТЕМА №1

«Ишемическое поражение головного мозга»

Ишемия головного мозга – прогрессирующая дисфункция головного мозга, возникшая вследствие существующей недостаточности кровоснабжения сосудов головного мозга.

Нарушения кровообращения в головном мозге, вызванные преимущественно тромбозом или сдавлением церебральных венозных синусов, крайне трудны для диагностики.

Использование адекватных и легко воспроизводимых моделей ишемических расстройств важно для поиска путей их фармакологической коррекции. Доминирующими в экспериментальных работах являются искусственно вызванные нарушения мозгового кровообращения артериального характера, в том числе и глобальная ишемия головного мозга. В большинстве экспериментальных моделей ишемии используют окклюзию сосудов. Принципиально все модели можно разделить на две группы глобальной и фокальной ишемии. Глобальная ишемия, моделируется окклюзией сосудов, вызывающей нарушение кровообращения и отек большей части переднего мозга. Фокальная (локальная) ишемия затрагивает лишь отдельные участки головного мозга.

В экспериментальной модели глобальной ишемии практикуют окклюзию двух общих сонных или четырех (две общие сонные и две вертебральные) артерий. При окклюзии двух вертебральных артерий получают избирательную ишемию заднего мозга. При окклюзии четырех артерий получают тяжелую двустороннюю ишемию головного мозга почти у 90% животных, которая развивается во всем бассейне кровоснабжения перекрытых артерий с характерными патоморфологическими, функциональными и биохимическими изменениями. Успешность ишемии данной модели зависит от анатомического строения сосудов, которое варьирует среди. Для экспериментальных исследований используют кроликов, песчанок, крыс или мышей.

Содержание лабораторных животных и экспериментальные работы проводятся в соответствии с биоэтическими нормативами, данными в руководстве «Guide for care and use f laboratory animals (ILAR publication, 2010, The National Academy Press)», Национальном стандарте РФ ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Приказе МЗ и СР Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 000н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Глобальная ишемия головного мозга осуществляется полной перевязкой обеих сонных (каротидных) артерий.

Показано, что после перевязки у крыс двух каротидных артерий давление крови в виллизиевом круге мозга падает до 40 мм рт. ст. Развивающаяся ишемия сопровождается массовой адгезией лейкоцитов к стенкам мозговых венул и мельчайших вен. Через два часа после перевязки давление крови в сосудах виллизиевого круга падает до 16 – 20 мм рт. ст. Количество актов адгезии резко возрастает. В указанных сосудах образуются лейкоцитарные конгломераты, которые вызывают полную окклюзию сосудов и гибель животных. Гибель животных в первые сутки достигает 80 %.

В первые 6 – 8 мин от начала острого нарушения кровообращения в зоне максимально выраженной олигемии (уменьшенное общее количество крови (сингиповолемия) формируется так называемая «ядерная» или «сердцевинная» зона инфаркта, окруженная потенциально жизнеспособной зоной «ишемической полутени» (пенумбра). В данной области также отмечается уменьшение кровотока, первоначально это сопровождается функциональными изменениями при относительно стабильном энергетическом метаболизме.

Улучшения кровоснабжения области головного мозга, подвергшейся ишемии вследствие закупорки кровоснабжающей ее артерии, называется реперфузией сосудов.

Восстановлением перфузии (кровоснабжение органов) можно «спасти» жизнеспособные, но функционально неполноценные клетки «ишемической полутени». Однако реперфузия (возобновление тока крови) может сопровождаться и пагубным воздействием - вызвать реперфузионное повреждение ткани мозга растущими метаболическими нарушениями. Иногда реперфузия приводит к большему тканевому повреждению, чем ее отсутствие. Это было показано на моделях ишемического инсульта на животных

Лабораторная работа №1

«Моделирование глобальной ишемии головного мозга крысы»

Эксперименты выполняются на крысах самцах линии Wistar массой 220-250 грамм, содержащихся в условиях 12/12 часового светового режима и получавших стандартный корм и питьевую воду ad libitum.

Наркотизировать животное (золетил – 30 мг/кг; хлоралгидрат – 300 мг/кг, внутрибрюшинно). После наркотизации животное перевернуть на спину, зафиксировать за конечности на операционном столике. Покинув грудную клетку, каждая сонная артерия направляется краниально и лежит параллельно трахее до уровня расположения щитовидной железы, где она разделяется на наружную и внутреннюю сонные артерии. Сделать паратрахеальный разрез между нижней челюстью и грудиной с последующим расширением операционной раны. Тупым способом отодвинуть железистую ткань, раздвинуть мышцы шеи до визуализации мышечного треугольника. На уровне щитовидного хряща гортани произвести выделение общей сонной артерии (ее диаметр около 1мм): выделить блуждающий нерв и освободить артерию от окружающей соединительной ткани на протяжении примерно 2 см длины. Следует проявлять осторожность, чтобы не повредить блуждающий нерв или внутреннюю яремную вену.