Микробные биотехнологии (стр. 2 )

3. Охарактеризовать регуляцию эффлюкс системы МасАВ. В третьей части проекта мы определим условия активации эффлюкс системы МасАВ.

4. Охарактеризовать устойчивость S. marcescens к антибиотикам в условиях, проводящим к активации эффлюкс системы МасАВ.

Общий план работ:

1. Будут подобраны условия культивирования бактерий на минимальной среде М9, подобрана концентрация перекиси водорода, достаточная для секреции антиоксиданта эффлюкс системой МасАВ, а также проведен первичный анализ культуральной жидкости с целью определения природы потенциального субстрата эффлюкс системы МасАВ.

2. Будут получены фракции культуральной жидкости штаммов дикого типа и ∆macAB Serratia marcescens, проведен их функциональный анализ с целью идентификации фракций, содержащих потенциальный субстрат эффлюкс системы МасАВ.

3. Будут инициированы работы по анализу фракций, содержащих потенциальный субстрат эффлюкс системы МасАВ.

4. Будут инициированы работы по конструированию штаммов S. marcescens, несущих гистидиновую метку на С-конце белков МасА и МасВ для проведения экспериментов, описанных в задаче 2.

5. Будут инициированы работы по получению штамма-репортера, несущего гены lacZY под контролем промотора macAB для проведения экспериментов, описанных в задаче 3.

6. Будет создан вектор, несущий гены lacZY под контролем промотора macAB для проведения экспериментов, описанных в задаче 3.

7. Будут проведены работы по идентификации субстрата эффлюкс системы МасАВ, а также по его дополнительной характеризации

Ожидаемые результаты:

Мы ожидаем, что реализация данного проекта позволит нам детально охарактеризовать механизм защиты S. marcescens от оксидативного стресса при помощи эффлюкс системы МасАВ. По окончании проекта мы сможем ответить на несколько важных вопросов:

1. Что является естественным природным субстратом эффлюкс системы МасАВ?

2. Какие белки S. marcescens взаимодействуют с эффлюкс системой МасАВ для защиты от токсичного действия АФК?

3. Что является сигналом для активации эффлюкс системы МасАВ в S. marcescens и какие генетические факторы вовлечены в регуляцию ее экспрессии?

4. Приводит ли активация эффлюкс системы МасАВ S. marcescens к изменению чувствительности к антимикробным препаратам.

Ответы на эти вопросы помогут нам приблизиться к разработке стратегии, блокирующей функционирование этой эффлюкс системы у бактерий.

10.2.  Наименование проекта 2: Министерство образования и науки РФ, государственное задание в сфере научной деятельности №14-83, «Микробные ферменты и метаболиты как основа новых биотехнологий в сельском хозяйстве»

Руководитель/ответственный исполнитель проекта: /

Краткая аннотация (0,5 страницы):

В проекте планируется разработать основы биотехнологического применения препаратов на основе бактериальных штаммов (Pantoe sp., Bacillus sp.), их ферментов (рибонуклеаза, протеиназы и фитазы) и вторичных метаболитов (ИУК и др.). Будет получены изоляты почвы и эпифитной микрофлоры с максимальной антагонистической активностью. Будет изучено влияния бактерий, продуцирующих фитазу, на рост и жизнеспособность растений в условиях фосфорного голодания. Бактериальные гидролазы, рибонуклеазы и протеиназы разных групп, будут исследованы на способность к подавлению фитопатогенных вирусов агрокультур и наличие активности, стимулирующей регенерацию меристемных эксплантов для получения здорового семенного картофеля. Будет исследовано пробиотическое действие бактериальных штаммов и их метаболитов в отношении растений для повышения урожайности и устойчивости к бактериозам, микозам и вирусным заболеваниями. Бактериальные метаболиты, обладающие антимикробным и ростостимулирующим действием будут выделены, охарактеризованы и апробированы в экспериментах с модельными растениями. Применение новых биоинженерных агробиопрепаратов на основе бактериальных штаммов и их ферментов позволит существенно экономить энергетические затраты, значимо сократить степень обогащения почвы минеральными добавками и представляет качественно новый этап в совершенствовании эффективности агропроизводства и сокращении затрат на единицу сельскохозяйственной продукции.

Общий план работ:

1. Скрининг штаммов бактерий из разных образцов почв с антагонистической активностью в отношении бактериальных и грибковых патогенов растений.

2. Секвенирование и аннотация геномов изолятов, обладающих высоким антимикробным потенциалом. Сравнительный анализ геномов выделенных штаммов с геномами известных патогенов растений для определения потенциала патогенности. Идентификация генов, ответственных за синтез антимикробных соединений.

3. Определение спектра метаболитов с антибиотической активностью. Выделение и очистка пептидных антибиотиков. Изучение их биосинтеза и влияния на различные фитопатогенные микроорганизмы.

4. Идентификация и характеристика штаммов с высокой секрецией органических кислот, способствующих подавлению роста патогенной микрофлоры. Выяснение роли микробных метаболитов в защите растений от патогенов.

5. Определение способности изолированных штаммов бактерий к биосинтезу стимуляторов роста растений и фитогормонов.

6. Оценка потенциала штаммов для профилактики и борьбы с инфекционными болезнями сельскохозяйственных культур в экспериментах с модельными растениями.

Ожидаемые результаты:

При выполнении проекта будут выделены и идентифицированы штаммы бактерий из разных образцов почв, обладающих антагонистической активностью в отношении бактериальных и грибковых патогенов растений. Геномы изолированных штаммов, обладающих высоким антимикробным потенциалом, будут секвенированы и аннотированы. Будет проведен сравнительный анализ геномов выделенных бактерий с геномами известных фитопатогенных микроорганизмов для определения потенциала патогенности изолятов. Гены, ответственные за синтез антимикробных соединений будут идентифицированы и проанализированы. В спектре продуцируемых бактериями метаболитов будут определение соединения с антибиотической активностью, которые будут выделены и очищены. Механизм их биосинтеза и влияние на различные фитопатогенные микроорганизмы будут изучены. Будет проведена идентификация и характеристика штаммов с высокой секрецией органических кислот, способствующих подавлению роста патогенной микрофлоры, оценена способность изолированных штаммов к биосинтезу стимуляторов роста растений и фитогормонов. В экспериментах с модельными растениями будет дана оценка потенциала использования штаммов для профилактики и борьбы с инфекционными заболеваниями сельскохозяйственных культур.

10.3.  Наименование проекта 3: РФФИ 16-08-00583, Гетерологичная экспрессия микробных фитаз в Arabidopsis thaliana для улучшения роста растений на фитат-обогащенных почвах

Руководитель/ответственный исполнитель проекта: /

Краткая аннотация (0,5 страницы):

Проект направлен на сравнительное исследование гетерологичной экспрессии генов бактериальных фосфигидролаз - гистидиновой кислой фитазы Pantoea agglomerans и щелочной бета-пропеллерной фитазы Bacillus ginsengihumi в растениях Arabidopsis thaliana. Будут разработаны экспрессионные системы, обеспечивающие направленную индуцибельную секрецию бактериальных белков в ризосферу модельных растений в условиях дефицита фосфатов в почве. Экспрессия бактериальных ферментов будет оцениваться на транскрипционном и трансляционном уровне. Проект предусматривает проведение сравнительных исследований по влиянию экспрессии бактериальных фитаз разных групп на урожайность растений. Для этого будут оценены рост и развитие растений на фитат-обогащенных средах в условиях дефицита свободных фосфатов, структура и степень ветвления корней, устойчивость модифицированных растений к стрессовым факторам, включая устойчивость к патогенам. Будет проведена сравнительная оценка содержания фосфатов в тканях модифицированных растений при их росте на различных средах для бактериальных фитаз разных групп. В рамках проекта планируется провести сравнительную характеристика корневых экссудатов линий растений с интегрированными генами бактериальных фитаз и дикого типа для выяснения влияния модификаций на состояние ризосферы растений, а также исследование по влиянию секреции рекомбинантных бактериальных белков на микрофлору ризосферы. Будет выяснено, как модификации отразятся на качестве семян, их способности к прорастанию. Сравнительный анализ полученных данных для рекомбинантных бактериальных фитаз разных классов позволит сделать заключение о практическом применении новой биотехнологии в практике.

Общий план работ:

Получение модифицированных растений A. thaliana, секретирующих бактериальные фитазы разных групп (гистидиновую кислую фитазу Р. agglomerans и бета-пропеллерную фитазу В. ginsengihumi) в ризосферу на фитат-обогащенных почвах 1) Получение векторной конструкции на основе гена фитазы P. agglomerans, включающей растительный промотор Pht1;2 и растительный сигнальный пептид. Аналогичная конструкция на основе гена бета-пропеллерной фитазы B. ginsengihumi уже получена нами (Nyamsuren et al., 2015). 2) Агробактериальная трансформация экспрессионных векторов в растения A. thaliana, отбор гомозиготных по интегрированному гену фитазы линий растений третьего поколения. 3) Выделение мРНК корней модифицированных растений и получение кДНК для анализа экспрессии бактериальных генов фитаз на уровне транскрипции (ОТ-ПЦР). 4) Оценка экспрессии бактериальных фитаз в модифицированных растениях с помощью иммуноблоттинга, установление локализации и молекулярной массы рекомбинантных белков.

Ожидаемые результаты:

1) Будет получена векторная конструкция, включающая ген гистидиновой кислой фитазы P. agglomerans, растительный индуцибельный промотор Pht1;2 эпителия корней A. thaliana и растительный сигнальный пептид гена экстенсина моркови (Ext), а также маркерный ген (bar), кодирующий устойчивость к гербициду BASTA. Аналогичная конструкция на основе гена бета-пропеллерной фитазы B. ginsengihumi в настоящее время нами получена (Nyamsuren et al., 2015). 2) Будет проведена агробактериальная трансформация экспрессионных векторов в растения A. thaliana и на селективной среде отобраны гомозиготные по интегрированному гену фитазы линии растений третьего поколения. 3) Будет выделена мРНК из корней модифицированных растений и получены соответствующие кДНК, проведен анализ экспрессии бактериальных генов фитаз на уровне транскрипции (ОТ-ПЦР). 4) Будет оценена экспрессия бактериальных фитаз в модифицированных растениях методом иммуноблоттинга и установлена локализация и молекулярная масса гетерологичных белков: гистидиновой кислой фитазы P. agglomerans и щелочной бета-пропеллерной фитазы B. ginsengihumi. Итак, на первом этапе проекта мы планируем получить модельные растения A. thaliana с интегрированными генами различных фитаз бактерий B. ginsengihumi и P. agglomerans под управлением индуцируемого голоданием по фосфатам растительного промотора Pht1;2, оценить экспрессию рекомбинантных бактериальных белков на транскипционном и трансляционном уровне и установить их локализацию в модифицированных растениях. Фитазы B. ginsengihumi и P. agglomerans обладают различными энзиматическими и биохимическими свойствами, и, прежде всего, проявляют активность при различных рН, что позволит использовать модифицированные растения в зависимости от условий выращивания в различных почвах