Микробные биотехнологии (стр. 4 )

Общий план работ:

В первый год работы над проектом планируется:

1. Будет проведен анализ микробного сообщества минеральных образцов.

2. Будет выполнен рентгенографический и химический анализ образцов минералов.

3. Будут выделены штаммы-продуценты сидерофоров различного типа. 

4. Будут подобраны оптимальные условия продукции сидерофоров выделенными штаммами. 

Во второй год работы над проектом планируется:

1. Будут просеквенированы и собраны геномы перспективных штаммов микроорганизмов.

2. Будет проведен бионформатический поиск генов, ответственных за синтез сидерофоров. 

3. Будут получены чистые фракции сидерофоров и идентифицированы химические структуры и аминокислотный состав сидерофоров. 

4. Будут охарактеризована способность сидерофоров к связыванию металлов и неметаллов.
В третий год работы над проектом планируется:

1. Будут выполнены эксперименты по исследованию генерации электричества чистыми культурами сидерофор-продуцирующих штаммов с подбором оптимальных условий для этого процесса.
2. Будут проведены эксперименты по исследованию генерации электричества отдельными фракциями сидерофор.

3. Будет выполнен рентгенографический и химический анализ образцов минералов после обработки чистыми культурами микроорганизмами, продуцирующими сидерофоры, а также после обработки фракциями сидерофоров.

Ожидаемые результаты:

В результате проведения планируемых экспериментов ожидается определить микробное разнообразие минеральных образцов. Будут выделены и идентифицированы микроорганизмы-продуценты сидерофор катехольного и гидроксаматового типов. Будут подобраны условия максимального накопления сидерофор в среде роста выделенными штаммами. Будут получены чистые фракции сидерофор, а также идентифицирована химическая структура и их аминокислотный состав. Будет исследован состав минеральных образцов до и после обработки нативным микробным сообществом, а также чистыми фракциями сидерофоров. Будет охарактеризована их способность к хелированию металлов (Fe, Zn, Ni, Cu, Mn, Co, Mo) и неметаллов (As, Se). Будет оценен потенциал генерации электричества чистыми культурами сидерофор-продуцирующих штаммов, а также отдельными фракциями сидерофор. Для выполнения всех экспериментов мы планируем использовать комплексный подход, основанный на сочетании современных методов в микробиологии, биохимии, протеомики, метагеномике, биоинформатике и аналитической химии.

10.7.  Наименование проекта 7: РФФИ_ мол_а_дк 2016-2018 "Сравнительный протеогеномный анализ штаммов Bacillus pumilus - продуцентов внеклеточных протеиназ и их мутантов"
Руководитель/ответственный исполнитель проекта: /

Краткая аннотация (0,5 страницы):

Проект направлен на выяснение взаимосвязи спонтанной устойчивости Bacillus pumilus к стрептомицину и повышением синтеза и секреции гидролитических ферментов. В ходе работы будет определен тип устойчивости к стрептомицину; выявлены молекулярные механизмы регуляции синтеза внеклеточных ферментов; определена роль секретируемых ферментов для клетки, в том числе в условиях стресса.

Общий план работ:

1. Сравнительный биоинформационный анализ геномов Bacillus pumilus 7Р и 3-19. 

2. Создание генетических конструкций, позволяющих инактивировать гены протеолитических ферментов без дополнительной интеграции генетических маркеров резистентности.
3. Трансформация разработанных генетических конструкций в штамм Bacillus pumilus 3-19.

4. Подбор условий протеомного эксперимента.

5. Протеогеномный анализ штаммов Bacillus pumilus - 7Р и 3-19. 

6. Определение дифференциально экспрессирующихся белков.

7. Характеристика новых штаммов с делециями по генам протеолитических ферментов - Bacillus pumilus.
8. Сравнительный протеомный анализ разработанных штаммов с делециями по генам протеолитических ферментов.

9. По совокупности данных проведен поиск механизма и сформулирована концепция о взаимосвязи между формированием устойчивости и активацией секреции гидролаз у бацилл.

Ожидаемые результаты:

В геномах Bacillus pumilus (7Р и 3-19) будут идентифицированы и охарактеризованы все гены протеолитических ферментов (функциональные и молчащие/несущие мутации или нуклеотидные замены).
Будут выявлены отличия в кодирующих последовательностях генов исследуемых штаммов Bacillus pumilus (диком - 7P и производных мутантных).

Будет определено наличие мутаций в генах (rpsL, rrn, rsmG, metK, mthA) способных привести к развитию устойчивости к стрептомицину.

Будет выявлена взаимосвязь между приобретенной устойчивостью и повышенным синтезом внеклеточных протеолитических ферментов.

Будет охарактеризован протеогеномный профиль штамма Bacillus pumilus 7Р и его селекционного мутанта Bacillus pumilus 3-19. Идентифицированы ключевые изменения в физиологии клетки в ответ на стресс (присутствие антибиотика), обнаружены различия в уровне внутриклеточных, мембраносвязанных и внеклеточных белков на разных фазах жизненного цикла у исходного и мутантных штаммов.

Будут получены делеционные мутанты по генам протеолитических ферментов (субтилизиноподобной протеиназе и глутамилэндопептидазе). Ген каждой протеиназы будет инактивирован без дополнительного внесения маркера резистентности. Таким образом, будут получены «чистые» делеционные мутанты. Будет дана морфологическая и физиологическая характеристика разработанных мутантных штаммов, описаны особенности их роста. Описаны протеомные профили делеционных мутантов. На основе анализа протеомных профилей делеционных мутантов, их физиологических и морфологических особенностей будет сделано заключение о функциональной роли исследуемых сериновых протеиназ в физиологии клеток бацилл.

10.8.  Наименование проекта 8: РФФИ 16-34-60191ю Разработка эффективных систем экспрессии фитаз для специфического получения мио-инозитол фосфатов.

Руководитель/ответственный исполнитель проекта: /

Краткая аннотация (0,5 страницы):

Аннотация: На сегодняшний день мио-инозитол фосфаты – соединения, обладающие потенциальными терапевтическими свойствами - получают лишь химическим путем, тогда как альтернативная экономически выгодная и экологичная технология ферментативного получения не развита. Стереоспецифичность реакции и экономическая выгода – основные преимущества ферментативного гидролиза c помощью микробных фитаз. Отсутствие токсичных побочных продуктов и мягкие условия протекания реакции обеспечат экологически чистое получение мио-инозитол фосфатов.
 Ранее из почв республики Татарстан нами был выделен штамм Pantoea sp.3.5.1, обладающий фитазной активностью. Был разработан эффективный способ очистки фитазы Pantoea sp. 3.5.1 и получен гомогенный препарат фермента. Впервые нами было показано, что конечным продуктом реакции гидролиза фитата фитазой Pantoea sp. 3.5.1 является D/L-мио-инозитол-1,2,4,5,6-пентакисфосфат.
Знания об абсолютной стереохимической специфичности фитат-гидролизующего фермента Pantoea sp.3.5.1 позволят использовать этот фермент для получения желаемых изомеров мио - инозитол фосфатов. Генерация данных соединений в промышленных масштабах возможна с помощью эффективной системы экспрессии фитазы для получения препаративных количеств фермента и последующей иммобилизацией белка на носителе, а количество желаемого продукта гидролиза контролируется количеством пассажей раствора мио-инозитолгексакисфосфата (фитата) через иммобилизованный фермент.
Таким образом, проект направлен на разработку эффективных систем продукции фитаз для специфического получения мио-инозитол фосфатов для фармацевтического производства.

Общий план работ:

1. Подбор оптимальной экспрессионной системы и клонирование гена фитазы Pantoea sp.3.5.1 в His-tag-вектор для его гиперэкспрессии в штамме E. coli BL21.

2. Оптимизация гиперэкспрессии фитазы Pantoea sp.3.5.1 в клетках E. coli BL21 и метода ее очистки. Получение гомогенного препарата фитазы.

3. Установление физико-химических, биохимических и энзиматических свойств рекомбинантного белка по сравнению с нативным и оценка возможности его использования для получения индивидуальных изомеров инозитол фосфатов.

4. Получение системы экспрессии гена бактериальной фитазы Pantoea sp. 3.5.1 с использованием дрожжевых интегративных векторов на основе штамма дрожжей Yarrowia lipolytica для внеклеточной продукции белка.

5. Подбор условий трансформации дрожжевых клеток для создания стабильных рекомбинантных штаммов Yarrowia lipolytica, экспрессирующих бактериальную фитазу.

6. Оптимизация условий культивирования и состава питательных сред для продукции целевого белка.

7. Выделение и очистка рекомбинантной фитазы из культуральной жидкости Yarrowia lipolytica.

8. Изучение и сравнительная характеристика физико-химических, биохимических и энзиматических свойств полученных препаратов рекомбинантных фитаз (полученных с использованием бактериальных и дрожжевых систем экспрессии) с нативным ферментом.

9. Подбор носителя для иммобилизации фитазы Pantoea sp.3.5.1 с целью создания технологии получения индивидуальных изомеров инозитол фосфатов.

Ожидаемые результаты:

В работе будет разработана оптимальная бактериальная экспрессионная система для клонирования гена фитазы Pantoea sp.3.5.1 в His-tag-вектор и получен рекомбинантный штамм E. coli BL21 с гиперэкспрессией фитазы.

Будет оптимизирована продукция и очистка фитазы Pantoea sp. 3.5.1 из клеткок E. coli BL21 и получен гомогенный препарат фермента. Будут детально изучены физико-химические, биохимические и энзиматические свойства рекомбинантного белка по сравнению с нативным и дана оценка возможности его использования для получения индивидуальных изомеров инозитол фосфатов.

В ходе выполнения работы будет разработана система экспрессии гена бактериальной фитазы Pantoea sp.3.5.1 в дрожжевом штамме Yarrowia lipolytica для внеклеточной продукции белка. Будут подобраны условия трансформации дрожжевых клеток для создания стабильных рекомбинантных штаммов Yarrowia lipolytica, экспрессирующих бактериальную фитазу. Будут оптимизированы условия культивирования и состав питательных сред для максимальной продукции целевых белков.