Микробные биотехнологии (стр. 3 )

10.4.  Наименование проекта 4: РФФИ-а №15-04-02110. Секретируемые сидерофоры Seratia marcescens и их роль в защите клеток от оксидативного стресса.

Руководитель/ответственный исполнитель проекта: /

Краткая аннотация (0,5 страницы):

Проект направлен на идентификацию сидерофоров Serratia marcescens и изучение их вклада в защиту бактерий от оксидативного стресса. Сидерофоры –это низкомолекулярные соединения, синтезируемые бактериями, грибами, растениями и животными для извлечения железа, находящегося в связанной форме из окружающей среды или из организма хозяина во время инфекции. Функции сидерофоров не ограничиваются их ролью в связывании железа. Новая, не до конца изученная роль сидерофоров, заключается в защите бактерий от оксидативного стресса. В рамках данного проекта будут секвенированы геномы двух штаммов Serratia marcescens, имеющих разное происхождение, с целью поиска генов, вовлеченных в биосинтез сидерофоров. Параллельно будут идентифицированы сидерофоры, присутствующие в культуральной жидкости Serratia marcescens, выращенной в условиях голодания по железу. Будут оптимизированы условия для максимальной продукции сидерофоров, проведен их структурный анализ. Полученные сидерофоры будут использованы для определения их способности к связыванию железа, в также будут охарактеризованы их антиоксидантные свойства. Данный проект позволит ответить на важные вопросы – является ли защитная функция сидерофоров во время оксидативного стресса консервативной для разных видов бактерий и каков механизм этой защиты.

Общий план работ:

В ходе реализации проекта планируется охарактеризовать продукцию сидерофоров Serratia marcescens и изучить их вклад в хелирование железа и защиту бактерий от активных форм кислорода (АФК) путем комбинирования методов геномики, молекулярной биологии и биохимии. В первый год работы над проектом планируется секвенировать штаммы Serratia marcescens, провести сборку генома и идентифицировать гены, вовлеченные в синтез сидерофоров. Одновременно будет проведен анализ культуральной жидкости S. marcescens c целью идентификации  сидерофоров в культуральной жидкости штаммов Serratia marcescens, выращенных в условиях голодания по железу. Путем фунционального анализа будет опредена их классовая принадлежность. Планируется оптимизировать условия культивирования штаммов для максимального накопления сидерофоров в среде роста, инициировать работы по очистке и получению отдельных фракций сидерофоров штаммов Serratia marcescens. Для реализации данной части проекта предполагается закупка реактивов для культивирования бактерий, очистки сидерофоров методом колоночной хроматографии, стандартов для ВЭЖК, материалов для тонкослойной хроматографии.
В последующие годы исследований планируется завершить определение химической структуры сидерофоров. Оценить способность идентифицированных сидерофоров Serratia marcescens к связыванию железа и измерить их антиоксидантные свойства. Провести функциональное исследование их роли в связывании железа и защите Serratia marcescens от АФК путем создания штаммов-нокаутов по производству сидерофоров того или иного класса, а также путем функциональной комплементации этих нокаутов при помощи очищенных сидерофоров. 

Ожидаемые результаты:

В результате проведения планируемых экспериментов ожидается определить наличие продукции сидерофоров катехольного и гидроксаматового типов у штаммов S. marcescens. При этом мы планируем использовать комплексный подход, основанный на сочетании геномики, биоинформационного анализа, микробиологии и биохимии Будут определены условия максимального накопления сидерофоров в среде роста штаммами S. marcescens. Будет идентифицирована химическая структура сидерофоров штаммов S. marcescens, а также аминокислотный состав. Будет охарактеризована их способность к хелированию железа и защите Serratia marcescens от оксидативного стресса как in vitro, так и in vivo.

10.5.  Наименование проекта 5: РФФИ-а №15-04-01645. Анализ естественной вариации популяций Arabidopsis thaliana по способности к росту на различных почвенных источниках фосфора.

Руководитель/ответственный исполнитель проекта: /

Краткая аннотация (0,5 страницы):

Проект направлен на изучение генетических и физиологических различий, демонстрируемых природными популяциями Arabidopsis thaliana по способности к использованию разли чных почвенных источников фосфора. В рамках проекта будет проведен анализ роста и ра звития 19 экотипов (естественных географически обособленных популяций растений, адаптировавшихся к разным ареалам обитания) растений Arabidopsis thaliana на различных ор ганических и неорганических источниках фосфора в среде. Будет проведен сравнительный анализ морфологических и физиологических параметров растений (внешний вид, прирост биомассы, изменения длины и морфологии корней), определены сухая масса и концентрация фосфора в растениях. Каждый из изучаемых источников фосфора будет проанализир ован на предмет эффективности его утилизации растениями.

Все используемые в работе экотипы A. thaliana будут также проанализированы на предмет способности секретировать из корней в окружающую среду фосфатазы и другие белки (секретом растений) в условиях роста на богатой и обедненной фосфором средах. Будет также проведен детальный анализ секретируемых растениями в разных условиях роста органических кислот (экссудат растений). Будут получены мутанты генов, регулирующих фосфорный гомеостаз, и проведено их изучение на предмет изменения фенотипов роста на средах с разными источниками фосфора. Совокупность описанных выше методов позволит детально изучить физиологические и генетические основы внутривидовой вариации в регуляции фосфорного метаболизма и путях адаптации растений к неблагоприятным условиям окружающей среды. Эти эксперименты позволят также лучше оценить возможность использования внутренних ресурсов растений в условиях роста на обедненных фосфором почвах.

Общий план работ:

1. Анализ роста, развития и физиологических параметров 19 экотипов растений A. thaliana при росте на твердых и жидких средах в присутствии неорганического фосфата Na2HPO4 и в отсутствии любого источника фосфора. Этот эксперимент позволит установить базовый уровень физиологического ответа растений на фосфорное голодание. Будут проведены следующие эксперименты с растениями в присутствии и отсутствии Na2HPO4: анализ прироста биомассы, измерение высоты и морфологии растений (побегов), длины и морфологии корней, соотношение длины побегов к длине корней, измерение сухого веса растений, измерение содержания фосфора в растениях.

2. Изучение роста и физиологических параметров 19 экотипов растений A. thaliana при росте на средах с разными органическими источниками фосфора. При росте на органических источниках фосфора помимо экспериментов, описанных в пункте 1, будет также проведен сравнительный анализ эффективности каждого из органических источников фосфора для поддержания устойчивого роста растений.

3. Изучение фосфатазной активности, секретируемой корнями 19 экотипов A. thaliana в условиях роста на богатой и обедненной минеральным фосфором средах, а также на средах с органическими источниками фосфора. Определение биохимическим путем ферментативных свойств секретируемых ферментов, их классификация на основе субстратной специфичности и механизмам ингибирования. Молекулярный и биохимический анализ индуцируемых ферментов растительных фосфатаз.

4. Изучение состава и композиции секретируемых корнями A. thaliana белков (секретома) при росте на богатой питательной среде и в ответ на фосфорное голодание, а также в ответ на присутствие в питательной среде органических источников фосфора.

5. Изучение состава и композиции секретируемых корнями A. thaliana органических кислот (экссудата) при росте на богатой питательной среде и в ответ на фосфорное голодание, а также в ответ на присутствие в питательной среде органических источников фосфора.

6. Геноинформационный анализ генов-кандидатов, их инактивация в геноме A. thaliana и изучение полученных мутантов на предмет изменения фенотипов роста на средах с разными источниками фосфора и общей морфологии растений.

Ожидаемые результаты:

Ожидаемые научные результаты к концу всего срока выполнения проекта.

1. Будет проведен анализ активности и белкового состава секретируемых фосфатаз при росте 19 экотипов A. thaliana на богатой и обедненной минеральным фосфором средах, а также на средах с органическими источниками фосфора.

2. Будут изучены состав и композиция секретируемых корнями 19 экотипов A. thaliana белков (секретома) при росте на богатой питательной среде и в ответ на фосфорное голодание, а также в ответ на присутствие в питательной среде органических источников фосфора.

3. Будет проведен анализ секретируемых корнями A. thaliana органических кислот (экссудата) при росте на богатой питательной среде и в ответ на фосфорное голодание, а также в ответ на присутствие в питательной среде органических источников фосфора.

4. Будет осуществлен биоинформатический анализ генов-кандидатов, а также осуществлена их инактивация в геноме A. thaliana и проведено изучение полученных мутантов на предмет изменения фенотипов роста на средах с разными источниками фосфора.

Предлагаемый нами подход позволит качественно и количественно оценить как влияние окружающей среды (в частности, количество и источник фосфора) на состав секретома и экссудата, так и влияние внутривидового генетического разнообразия экотипов A. thaliana на физиологический ответ растений.

10.6.  Наименование проекта 6: РФФИ № 16-34-60200 "Роль бактериальных сидерофоров в процессах биоминерализации и электрогенезиса" 

Руководитель/ответственный исполнитель проекта:

Краткая аннотация (0,5 страницы):

Различные виды микроорганизмов, их симбиотические ассоциации и биопленки, вносят существенный вклад в процессы биоминерализации. Результатом микробного метаболизма с разнообразными внутри - и внеклеточными биохимическими реакциями является растворение, преципитация, связывание, а также биотрансформация или деградация минералов различного происхождения. Перспективными для исследований остаются месторождения карбонатно-силикатного состава, представленные серпентинитом, гидромагнезитом или магнезитом. Экстремальные условия серпентинитовых источников являются подходящими для выделения металл-толерантных сидерофор-продуцирующих микроорганизмов, эффективных в процессах био - или фиторемедиации. Хелатирование металлов микробными сидерофорами особенно важный процесс, протекающий при колонизации минеральных поверхностей, в результате чего формируется микросреда, в которой микроорганизмам легче получать необходимые элементы. Сидерофоры металл-толерантных бактерий служат посредниками для переноса электронов на твердые поверхности. Участие медиаторов в процессах растворения твердых акцепторов электронов является важным звеном в широком спектре экологических и энергетических процессов, включая биогеохимические циклы металлов, деградацию природных и антропогенных токсикантов, биоминерализацию минералов, восстановительную преципитацию токсичных металлов и радионуклеотидов, генерацию электричества в микробных топливных ячейках.