Деринат защищает кожу от ультрафиолет (УФ-В) индуцированного повреждения клеток (стр. 2 )

Рисунок 2. Влияние Дерината на концентрацию внутриклеточного Са 2+ в клетках кожи подвергшихся  УФ-B воздействию. Экспериментальный дизайн для обработки каждой группы: контрольная группа, УФ-B, ЭДТА, УФ-В + Деринат, и только Деринат; ( B ): калибровочная кривая концентрации  Ca 2+ ; ( С, D ): среднее  значение внутриклеточного Са 2+, УФ-В-воздействию, УФ-В облучение + экспонирование с  различными концентрациями ЭДТА, УФ-B-облучения с Деринатом  и только Деринатом  в KЦ и КФ культивировали  в BSS ( balanced salt solution - cбалансированный солевой раствор )  в течение 30 мин (* , р <0,05; *** , р <0,001); ( Е ) КЦ и ( F ) КФ были предварительно обработаны с использованием или без использования  Дерината в течение 24 ч и затем их подвергали воздействию УФ – B излучения. Концентрацию  внутриклеточного Ca 2+ затем измеряли через 24 ч инкубации в нормальной среде ( *** , р <0,001).

Для того, чтобы исследовать механизм, с помощью которого Деринат блокирует ток ионов Ca 2+, клетки кожи были предварительно обработаны  Деринатом в течение 30 мин, и  затем был проведён  анализ изображений. Сначала мы использовали тапсигаргин (ТГ) для повышения уровня цитозольного Ca 2+ путём истощения депо Ca 2+. Как показано на рисунке 3 A и B, УФ-B облучение не влияет на ТГ-активированный Ca 2+ ток в клетках кожи. Далее мы определили,  влияет ли УФ-В облучение на способность  катионных каналов суперсемейства TRP  изменять ток Са2+? Так например, диацилглицеринацилтрансфераза (DAG) активизирует большинство  каналов суперсемейства TRP [ 23 , 24 ], и ультрафиолетовое (УФ) облучение увеличивает концентрацию  DAG [ 25 ], в предыдущих исследованиях была  выдвинута гипотеза, что TRP каналы могут способствовать УФ-B-индуцированному повышению  внутриклеточного Ca 2+ в коже [ 23 ]. Впоследствии обнаружилось, что оно предшествует повышению уровня катионов Ca 2+.  Как показано на рисунке 3 (С, D) Деринат,  борат 2-аминоэтоксидифенила  (2-АПБ)  (представляет собой химическое вещество, лабораторный  ингибитор каналов суперсемейства TRP в малых дозах, но стимулятор классов  TRPV1, TRPV2, TRPV3 этого семейства в больших дозах.) и SKF96365 (Блокатор каналов суперсемейства TRP. Угнетает объёмный входящий ток  Ca 2+)[ 26 , 27 ] значительно уменьшают зависимое  от DAG аналога 1-олеоил-2-ацетил - SN-глицерина (ОАГ) (Проницаемый аналог PKC - и zeta активирующего второй  внутриклеточный месседжер  DAG. Например,  PKC 412 угнетает рост или индуцирует апоптоз во многих типах раковых клеток, блокирует ангиогенез в опухоли, и сенсибилизирует раковые клетки к ионизирующей радиации, поддерживая его применение в терапии рака.), повышение  проницаемости  мембраны для  Са 2+ в КЦ и КФ после 30 минут облучения  УФ-B. Медикаментозный пик  внутриклеточного тока Са 2+ был заблокирован Деринатом  при облучении  в диапазоне от 970 нм до 800 нм для кератоцитов (рис 3 E) и от 1300 до 1100 нм для кожных фибробластов (рис 3 F), соответственно. Согласно исследованию Венкатачалам, опубликованном в 2007 году, каналы суперсемейства TRP, классы: TRPV1 и TRPA1 активируются DAG [ 24 ]. Тем не менее, на Рисунке 3 C-F показано, что классы TRPV1 и TRPA1 этого суперсемейства  не участвуют в УФ-B индуцированном повышении уровня  Ca 2+ что доказывается отсутствием повышения Са 2+ при контрольной экспозиции клеток  с боратом 2-аминоэтоксидифенила  (2-АПБ) [ 28 , 29 ]. В то время как Деринат и ингибиторы эффективно блокировали каналы суперсемейства TRP  при их активации с помощью  диацилглицеринацилтрансферазы (DAG)  после 30 мин облучения  УФ-B, мы подтвердили, что они могут быть вновь активированы УФ-В. Аденозинтрифосфат (АТФ) был применен в качестве стимулятора, чтобы вызвать реакцию каналов TRP, так как АТФ активирует фосфолипаза-C зависимый путь сигнализации, который вызывает открытие TRPCs [ 30 , 31 , 32 ,33 ]. Мы в первую очередь проверили эффект АТФ на Ca 2+ реакцию в клетках кожи. Облучение УФ-B слегка повышало уровень АТФ активированного Ca 2+, который снижался после  обработки  Деринатом, SKF96365 и 2-АПБ (рисунок 3 G-J). Таким образом подтверждается  активация  каналов TRPCs по фосфолипаза-C - зависимому пути передачи сигнала. Как показано на рисунке 3 K-N, Деринат и лабораторные  ингибиторы сдерживают УФ-B-индуцированное увеличение тока Ca 2+ путем стимуляции фосфолипазы - C  в клетках кожи..  На основании наших результатов  мы  можем исключить участие  TRPM5 и TRPM7 (TRPM – «Меластатиновое» ('Melastatin') семейство суперсемейства TRP.) в фосфолипаза-C - зависимом пути  увеличения тока  Ca 2+. Например, каналы класса TRPM5 в коже присутствуют в очень небольшом количестве [ 34 ]; А класс каналов TRPM7 не может быть активирован с помощью диацилглицеринацилтрансферазы DAG. Поэтому селективная блокада каналов суперсемейства TRP указывает что Деринат уменьшает УФ-B-активированное  повышение Са2+ на начальной стадии. Интересно, что через 24 ч УФ-B облучения, каналы классов TRPC1, TRPC4, TRPC6 и TRPC7, которые начинают экспрессироваться  в клетках кожи  [ 34 ], также блокируются Деринатом и 2-AПБ, особенно каналы класса TRPC7 ( Рисунок 4 А, В). Исходя из своих физико - химических особенностей Дерината и  каналов TRPCs, первый  может блокировать активность каналов аналогичным образом, как тетродотоксин (ТТХ) блокирует натриевые каналы [ 35 ]. Тем не менее, в отличие от ТТХ, Деринат отрицательно заряжен, и, поэтому, не может заблокировать каналы. Кроме того, гетерогенная смесь ДНК уменьшает альтерацию, так как местно нанесённый  раствор поглощает УФ-B излучение, предотвращая повреждение клеток. За исключением случаев УФ-B-индуцированной активации  каналов TRPCs, Деринат содержит гетерогенную ДНК которая может защитить клетки кожи от повреждения  с помощью поглощения света в диапазоне УФ-B.

Рисунок 3. Деринат снижает УФ-B активированные Ca 2+ сигналы в клетках кожи. Са2+ визуализация тапсигаргин (TG)- индуцированной  Ca 2+ реакции после применения 20 нМ TG (маленькие черные полосы) в  кератоцитах (А) и 100 нМ TG в кожных фибробластах (В)  ( п = 3). Через 30 мин после предварительной обработки  Деринатом (D), SKF96365 ( 20 мкМ для КЦ и 50 мкМ для КФ), боратом 2-аминоэтоксидифенила (2-АПБ, 50 мкМ для КЦ и 100 мкМ для КФ), SKF96365 + Деринат; 1-олеоил-2-ацетил - SN-глицерин (ОАГ) при 100 мкМ и 200 мкМ вносили в пробирку с КЦ  ( C )  и  КФ (D), соответственно, для стимуляции  Ca 2+ реакции каналов TRPCs через 30 минут лучевого воздействия  ( п = 3). ( E, F ) количественное определение пика внутриклеточных Ca 2+ реакций, показанных на ( C ) и (D ) (*, р <0,05; **, р <0,01; ***, р <0,001). Са2+ визуализация анализа  аденозинтрифосфат (АТФ)- индуцированной Ca 2+ реакции. Применение 100 мкМ АТФ (небольшие черные полосы) для КЦ  ( G ) и 200 мкМ АТФ для КФ (H ) ( п = 3). ( I, J ), количественное определение пика внутриклеточных Ca 2+ реакций, показанных в ( G, H ) (*, р <0,05; ***, р<0,001). CaCl 2 был применен внеклеточно (большой черный столбик) для увеличения Ca 2+ от 0 до 2 мм и открытия каналов TRPCs после применения АТФ (небольшие черные полосы) в кератоцитах ( K ) и в кожных фибробластах ( L ) в  растворе  BSS (условно физ. раствор.)  свободном от Ca 2+ (неокрашенный столбик) ( п = 3). ( M, N ) Количественное изображение пика внутриклеточных Ca 2+ реакций, показанных в ( K, L ) после применения CaCl 2 (*, р <0,05; **, р <0,01; ***, р <0,001). Ca 2+ сигналы представлены  средним значением, полученным от 20 клеток.

Рисунок 4. Деринат значительно ингибирует УФ-B-индуцированное увеличение экспрессии Са2+ каналов класса TRPC7 в клетках кожи. Клетки подвергали воздействию УФ - облучения после обработки Деринатом и 2-АПБ в течение 30 мин. После облучения, в течение 24 ч измеряли экспрессию каналов TRPC1, TRPC4, TRPC6 и TRPC7  по содержанию  в растворе экстрактов  м-РНК, обнаруженных от общего количества экстрактов РНК ( А ) в пробирке с кератоцитами и ( B ) в пробирке с кожными фибробластами, измеряли с помощью ОТ - модификации ПЦР (*, р <0,05 ; **, р <0,01; ***, р <0,001).

Обобщённо, эти результаты свидетельствуют о том, что Деринат действует как блокатор каналов TRPCs уменьшая содержание внутриклеточного Ca 2+ . В будущем важно определить  вклад каждого класса каналов суперсемейства  TRPCs участвующего в регуляции УФ-В активированного повышения уровня Ca 2+ с использованием si-РНК  (малые, интерферирующие РНК, класс 2-х цепочечных РНК).

2.3. Деринат снижает оксидативный  стресс  после УФ-В  облучения клеток кожи.

Первым ответом на увеличение УФ-B-индуцированных  активных форм кислорода (АФК) в клетках кожи является повышение внутриклеточного Ca 2+ [ 21 ]. На основании полученных данных  Деринат уменьшал УФ-B-индуцированное повышение Ca 2+ . Эти результаты свидетельствуют о том, что Деринат защищает клетки кожи от УФ – В индуцированного повреждения. Это происходит за счет снижения уровня Са 2+ стимулированной  внутриклеточной продукции АФК митохондриями. Мы проверили эту гипотезу, выполнив следующий эксперимент: тридцать минут после воздействия УФ-B, уровень внутриклеточных АФК слегка увеличился на 1,25 раза в КЦ ( Рисунок 5 A, C). Предварительная обработка  Деринатом  или N - ацетилцистеином ​​(НАЦ), который по некоторым сообщениям является  внутриклеточным  поглотителем АФК, ингибирует УФ-B-индуцированное внутриклеточный синтез АФК и повреждение ДНК в клетках кожи [ 36 ]. Инкубация клеток с ЭДТА после воздействия УФ-B даёт аналогичные результаты. Интересно отметить, что эффекты Дерината и НАЦ на кожные фибробласты не отличались после 30 мин воздействия УФ-B ( рис 5 В, D). Тем не менее, как КЦ так и КФ показали снижение уровня внутриклеточной генерации активных форм кислорода через 24 ч после обработки Деринат и НАЦ при воздействии УФ-B  (Рисунок 5 E, F). Измеренные объемы синтеза внутриклеточных АФК в КЦ и КФ показали, что Деринат снижает их уровень  УФ-B-индуцированной продукции  с 2.25- до 1,67 раза и с 2.52- до 1,53 раза для кератоцитов  и кожных фибробластов, соответственно ( рис 5 G, H ). Аналогичные результаты были получены в группе предварительной обработки НАЦ ( Рисунок 5 G, H). Эти результаты четко показывают, что Деринат подавляет УФ-В-индуцированный внутриклеточный синтез АФК за счет блокады внутриклеточного Са 2+ в клетках кожи.