Деринат защищает кожу от ультрафиолет (УФ-В) индуцированного повреждения клеток (стр. 1 )

Деринат защищает кожу от ультрафиолет (УФ-В) индуцированного повреждения клеток.

1

Институт фундаментальных медицинских наук, медицинский колледж, National Cheng Kung University, 1 University Road, Тайнань 70101, Тайвань

2

Научно-исследовательский центр изучения липидов и старения, Медицинский университет Гаосюн, Гаосюн 80708, Тайвань

3

Высший институт медицины, медицинский факультет, медицинского университета Гаосюн, № 000, Shih-Chuan первый Road, Гаосюн 80708, Тайвань

4

Лаборатория патофизиологии, Высшая школа фармацевтических наук, Университет Кюсю, 3-1-1 Maidashi, Хигаси-ку, Фукуока 812-8581, Япония

5

Отделение дерматологии, медицинского университета Гаосюн, № 000, Ши-цюань 1 Road, Гаосюн 80708, Тайвань

6

Школа Высоких Технологий благополучия человека, Университета Токай, 410-0321 Numazu, Сидзуока, Япония

7

Научно-исследовательский институт Национального здравоохранения, Национальный научно-исследовательский центр гигиены окружающей среды, № 35, Keyan Road, Zhunan Town, Miaoli County 35053, Тайвань

8

Школа фармации, медицинского университета Гаосюн, Гаосюн 80708, Тайвань

9

Центр исследований стволовых клеток медицинского университета, Гаосюн 80708, Тайвань

10

Отдел физиологии, медицинский колледж, National Cheng Kung University, 1 Университет Роуд, Тайнань 70101, Тайвань

Абстракт.

Ультрафиолет-B (UVB) является одним из наиболее цитотоксических и мутагенных излучений, вызывающих повреждение кожи и старение путем повышения содержания внутриклеточного Ca 2+ и активных форм кислорода (АФК). Деринат (дезоксирибонуклеат натрия) был использован в качестве иммуномодулятора для лечения заболеваний индуцированных АФК  в клинике. Молекулярный механизм с помощью которого Деринат защищает клетки кожи от УФ - индуцированного повреждения мало изучен. Здесь мы покажем, что Деринат значительно ослабляет UVB-индуцированную продукцию внутриклеточного АФК и уменьшает повреждения ДНК в собственных клетках кожи. Кроме того, Деринат снижает содержание внутриклеточных АФК, активацию циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) и повреждение ДНК в коже мышей линии BALB / C-Nu, подвергнутых воздействию UVB в течение семи дней. Важно отметить, что Деринат блокирует классических потенциал зависимых кальциевых каналов  класса «С», «канонических»\ (TRPCs), что было показано с помощью  визуализации потока кальция. Таким образом наши результаты показывают, что Деринат действует как блокатор TRPCs, уменьшающий внутриклеточный образование внутриклеточных АФК и повреждение ДНК при УФ - облучении. Этот механизм обеспечивает потенциальное новое применение Деринат для защиты от УФ - индуцированного повреждения кожи и старения.

Ключевые слова: Деринат; УФО; АФК; кальций; TRPCs.

1. Введение

Ультрафиолетовое излучение (УФО) является основным этиологическим фактором старения кожи и связанных с ним заболеваний и симптомов, таких как морщины, эпидермальная гиперпигментация, повышенный синтез меланина и раковые заболевания [ 1 ]. Среди трех видов УФО в солнечном свете, ультрафиолетовое-В (УФ-В), излучение 280-320 нм) является наиболее цитотоксическими и мутагенными электромагнитными волнами, а также способствуют повреждению кожи и старению [ 2 , 3 ]. Так как энергия УФ-B достаточна для создания активных форм кислорода (АФК) в живой ткани, она приводит к нарушению ДНК и онкогенезу в коже, связанному с внутриклеточным повышением  Са 2+ [ 4 , 5 ]. Эти факты были установлены независимо друг от друга. В настоящее время молекулярные и клеточные связи между увеличением АФК и внутриклеточного Ca 2+ в живых клетках недостаточно хорошо изучены. Хотя было разработано большое количество соединений и препаратов, чтобы исследовать механизм УФ-B - индуцированного повреждения кожи за счет повышения АФК и Ca 2+ [ 6 , 7 , 8 , 9 ], приемлемые модели для объяснения отношений между УФ-B, потока в клетку Ca 2+ , повреждения ДНК и клеток отсутствуют, поскольку модели внутриклеточного влияния  АФК изучаются  в различных областях биохимии и физиологии. Из-за разрыва между экспериментальными результатами исследований in vitro и in vivo, которые не позволяют проводить прямые сравнения, трудно объяснить токсическое действие УФ-B на кожу с помощью этих разных моделей. Кроме того были предприняты попытки применения нескольких типов веществ подавляющих УФ повреждение: путём непосредственного добавлением к среде in vitro и косвенного воздействия на клетки (внутрисосудистой инъекции) in vivo. Таким образом, чтобы примирить фундаментальные различия между экспериментальными результатами in vivo и in vitro, мы попытались определить подходящий препарат для изучения молекулярного механизма, с помощью которого УФ-B индуцирует повреждение кожи и старения.

Деринат (дезоксирибонуклеат натрия), является популярным клиническим препаратом с многолетней историей и опытом использования в России. Он содержит натриевую соль ДНК, выделенной из молок Acipenser gueldenstaedtii (осетровых рыб), который деполимеризуется в 0,1% растворе хлорида натрия до частиц с молекулярной массой 270-500 кД с использованием ультразвука[ 10 ].Клинические исследования показали, что Деринат имеет уникальные иммуномодулирующие свойства, которые применяются для патогенетического лечения, сепсиса, воспалительных состояний и язв. [ 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ,16 ]. Например, в исследовании по терапии ревматоидного артрита, Деринатом было обнаружено, что он подавляет фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа) и ускоряет бласттрансформацию лимфоцитов у крыс [ 17 ].Деринат также использовался в качестве терапевтического средства в клинике при терапии различных инфекций, воспалительных состояний и язв, которые коррелируют с повышением синтеза АФК[ 18 , 19 , 20 ]. Тем не менее, большинство молекулярных механизмов, с помощью которых функционирует Деринат, остаются неясными. Таким образом, Деринат будет хорошим препаратом, чтобы понять механизм УФ-B - индуцированного клеточного повреждения in vivo и in vitro.

Мы предположили, что Деринат защищает кожу от УФ - индуцированного повреждения путем ингибирования внутриклеточного повышения Ca 2+ , в свою очередь вызванного блокадой каналов суперсемейства TRP (transient receptor potential channels). Наше исследование выявило основные механизмы, с помощью которых Деринат защищает кожу от УФ - индуцированного разрушения кожи в пробирке и in vivo. С этой целью мы использовали кератиноциты (КЦ) и кожные фибробласты (КФ) крайней плоти человека, а затем исследовали УФ-B-индуцированные повреждения этих клеток кожи в пробирке. Кроме того, для исследований in vivo, мы изучили УФ-B-индуцированные симптомы повреждения кожи у голых мышей. Наши результаты показали, что Деринат существенно защищает не только клетки кожи, но и эпидермис голых мышей от УФ-B-индуцированного повреждения. Суммарно, эти результаты свидетельствуют о том, что Деринат уменьшает старение кожи путем угнетения внутриклеточного повышения концентрации Ca 2+ и может быть полезен для профилактики и лечения возрастных заболеваний, ассоциированных с этими симптомами.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Деринат защищает клетки кожи от повреждений, вызванных УФ облучением.

Для изучения влияния Дерината на УФ-В - индуцированное повреждение кожи, мы сначала определили эффективную дозу препарата в клетках кожи in vivo с использованием человеческих кератиноцитов (КЦ) и кожных фибробластов (КФ). Клетки кожи облучали различными дозами УФ-B, а затем определяли жизнеспособность клеток количественно, для различных доз радиации, как описано в экспериментальном разделе. Рисунок 1 Пункты A и B показывают, что 45% КЦ и 65% КФ выжили после воздействия УФ-B интенсивностью 50 мДж / см 2 и 100 мДж / см 2 , соответственно. Клетки  предварительно обрабатывали  различными концентрациями Дерината с последующим кондиционированием  в течение 24 ч. Использовали 15 мкг / мл Дерината для КЦ ( рис 1 С) и 150 мкг / мл Деринат для КФ, а затем облучали УФ – B. Такой подход эффективно предотвращал  УФ-B-индуцированное повреждение в клетках кожи ( Рисунок 1 D). Никаких дополнительных токсических эффектов не наблюдалось в ответ на обработку клеток Деринатом. ( Рисунок 1 C, D). Выживаемость КЦ и КФ была 70% и 78% соответственно ( Рисунок 1 E, F). Эти результаты показали, что Деринат способствует выживаемости кератоцитов и кожных фибробластов в ответ на УФВ-индуцированное повреждение.

Рисунок 1.

Рисунок 1. Деринат защищает клетки кожи от повреждения УФ-B. Эффект УФ-В облучения на жизнеспособность клеток в ( А ) кератиноцитов (КЦ) и ( Б ) фибробласты кожи человека (КФ) ( *** ,р <0,001). Вероятность выживания клеток для клеток, предварительно обработанных различными концентрациями Деринат в течение 24 ч облучённых  или без УФ-В-облучения в ( C ) KЦ и ( D ) КФ ( * , р <0,05;*** , р <0,001). Далее для подтверждения результата (C, D ), в ( Е ) KЦ и ( F ) КФ  предварительно обрабатывают с помощью 15 мкг и 150 мкг Деринат и облучали Е=50 мДж / см 2 и Е=100 мДж / см 2, соответственно. Вероятность выживания клеток анализировали с помощью МТТ через 24 ч UVB-облучения ( * , р <0,05; *** , р <0,001). (MTT-тест – это колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток.  НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток.)

  2.2. Деринат сокращает повышение концентрации внутриклеточного Са 2+ в клетках кожи, подвергнутых УФО.

Предыдущие исследования показали, что УФ-B - излучение увеличило внутриклеточную концентрацию Ca 2+ и вызывало  повреждение и старение кожи [ 21 , 22 ]. Поэтому мы предположили, что Деринат защищает клетки кожи от УФ - B - индуцированного повреждения, блокируя повышение  внутриклеточного Ca 2+. Чтобы проверить эту гипотезу,  мы измерили концентрацию  внутриклеточного Ca 2+ с помощью Fluo-4 окрашивания. Клетки кожи подвергались УФ - облучению после предварительной обработки  Деринатом в течение 24 ч. Через 30 мин УФВ облучения концентрация  внутриклеточного Са 2+ измерялась с использованием флуоресцентного микроскопа Olympus со средней интенсивностью флуоресценции клеток  более 150. Экспериментальный протокол для каждой группы представлена ​​на рисунке 2 А, а калибровочная кривая  Са 2+ была сгенерирована из расчёта его внутриклеточной концентрации в клетках кожи под микроскопом ( рис 2 B). Рисунки 2 C, D показывают, что Деринат почти полностью блокировал УФ-В-индуцированное внутриклеточное повышение Ca 2+ в КЦ, в то время как он показал меньшую, но статистически значимую блокаду  Ca 2+ в УФ-B обработанных КФ. Эти результаты свидетельствуют о том, что Деринат блокирует УФ-B-индуцированное повышение Ca 2+ в обоих типах клеток КЦ и КФ. Мы также проверили состояние  клеточного окружения на предмет увеличения УФ-B-индуцированного  повышения концентрации  Са 2+ . Применение этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), образующей хелатный комплекс с  внеклеточным Са 2+ , показывает снижение концентрации  внутриклеточного Са 2+ в зависимости от дозы Дерината в клетках кожи через 30 мин после УФ-В облучения ( рис 2 C, D). Результаты показывают,  что Деринат снижает УФ-В-индуцированный ток ионов Са 2+ из внеклеточного пространства во внутриклеточное пространство. Интересно, что Деринат также блокирует повышение концентрации Ca 2+ в клетках кожи через 24 ч после облучения УФ-B ( Рисунок 2 E, F). Возможно, Деринат блокирует некий начальный триггер для УФ-B-индуцированного  повышения Ca 2+ в клетках кожи.