Деринат защищает кожу от ультрафиолет (УФ-В) индуцированного повреждения клеток (стр. 3 )

2.4. Деринат защищает клетки кожи от УФ-В-индуцированного повреждения ДНК.

УФВ-индуцированная генерация  внутриклеточных АФК через оксидазный путь утилизации,  способствует повреждению ядерной и митохондриальной ДНК. Оба процесса  наблюдаются  при накоплении 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (8-oxodG) в клетках кожи [ 37 , 38 ]. Как было показано в наших результатах исследований  выше, Деринат может защитить клетки кожи от УФ-B-индуцированного повреждения ДНК за счет снижения уровня внутриклеточного продукции АФК. Мы следующим образом  исследовали влияние Деринат на УФ-B-индуцированные повреждения ДНК. Клетки кожи были предварительно экспонированы с  Деринатом или НАЦ в течение 24 ч, Затем измеряли  соотношение повреждения ДНК и уровня 8-oxodG через 24 часа после облучения УФ-В. Предварительная обработка  кератоцитов Деринатом и НАЦ уменьшило отношение повреждения ДНК с 51% до 12% и от 51% до 23% соответственно ( рис 6 А, В). Аналогичные результаты наблюдались также в кожных фибробластах, но Деринат и НАЦ после предварительной обработки снижает соотношение количества повреждений ДНК до 2% и 3%, соответственно (рис 6 C, D). Эти результаты подтверждают наши выводы выше для клеток кожи: Деринат защищает их от УФ-B-индуцированной альтерации за счет подавления роста внутриклеточного Ca 2+, подавления генерации активных форм кислорода и повреждений ДНК, препятствуя ухудшению кожи и уменьшая потенциал старения.

Рисунок 5. Влияние Деринат на УФ-B индуцированный  внутриклеточный синтез АФК в клетках кожи. ( А) кератоциты и ( Б ) кожные фибробласты были предварительно обработаны  Деринатом и 0,5 мМ раствором НАЦ в течение 24 ч, а затем облучены УФ-B. ЭДТА (1 мМ) наносили после облучения УФВ. Уровень АФК измеряли через 30 мин УФ-В облучения с использованием 5 мкМ dihydroethidium (ДНЕ) окрашивания. Уровень продукции внутриклеточного АФК со средней интенсивностью флуоресценции более 150 клеток  ( А ) и ( В ) количественно для КЦ ( C ) и КФ ( D ) (***, р<0,001; *, р <0,01) , Для дальнейшего исследования внутриклеточной генерации активных форм кислорода в КЦ ( Е ) и КФ ( F ), клетки культивировали в нормальной среде в течение 24 ч после УФВ-облучения. Внутриклеточная продукция АФК была зафиксирована с помощью конфокального микроскопа с использованием ДНЕ окрашивания. Количественное определение внутриклеточной продукции активных форм кислорода из ( E, F ) показано в ( G, H ) (***, р <0,001).

Рисунок 6. Влияние Дерината на УФВ-индуцированное повреждение ДНК в клетках кожи. Был измерен 8-oxodG, чтобы зафиксировать повреждение ДНК в результате УФВ-облучения в клетках, предварительно обработанных  Деринатом и НАЦ: (А) кератоциты  и кожные фибробласты ( С ). Относительные величины повреждения ДНК по отношению к  8-oxodG количественно  ( B, D ) (**, р<0,01; ***, р <0,001). Приведенные данные  представляют собой среднее измерение из трех независимых экспериментов.

2.5. Деринат защищает мышей линии BALB / C-nu от УФB-индуцированных повреждений кожи.

Далее мы исследовали, защищает ли Деринат кожу мышей линии BALB / C-nu от УФB-индуцированного повреждения в путем наблюдения за десквамацией, толщины эпидермиса, синтеза АФК и повреждения ДНК. Деринат относится к водорастворимым агентам, поэтому его не легко вводить кожу. Мы сотрудничали с компанией SOMAPEX Biotech & Co(Гаосюн, Тайвань) с целью разработки специального гидрогеля Деринат (D-гидрогеля). Деринат гидрогель помогает ткани кожи поглощать препарат, обеспечивая равномерное распределение дозы на поверхности кожи [ 39 , 40 ]. Деринат-содержащий гидрогель нанесли на круговые чипы 3-см в диаметре. Три различные концентрации Дерината в гидрогеле были подготовлены к эксперименту в естественных условиях: 0 (контроль), 3,5 мкг / см І(15 мкг / мл) и 14 мкг / смІ (60 мкг / мл). В ходе эксперимента мышей линии BALB / C-nu механически иммобилизовали. Кожа каждой мыши была покрыта различными концентрациями Деринат гидрогеля в течение 3 ч. Через 3 часа после обработки, мышей линии BALB / C-nu облучали УФ-В с Е= 360 мДж / смІ [ 6 ]. Через семь дней это излучение привело к серьезному шелушению и эритемы на коже спины в мышей линии BALB / C-nu, как показано на рисунке 7 A, в то время как 3,5 мкг / смІ и 14 мкг / смІ Дерината гидрогеля смягчали этот УФВ-индуцированное повреждения кожи животного. Кроме того, область кожи брюха каждой мыши использовали в качестве контроля, и никакого эффекта от облучения в этой области не наблюдалось. Лечение Деринатом блокировало уменьшение толщины эпидермиса и внутриклеточную продукцию АФК, индуцированную УФ-B (рис 7 B, C). Концентрация  внутриклеточного Са 2+ может  регулироваться циклооксигеназой-2 (ЦОГ-2), от которой, как известно, зависит УФ-B индуцированное воспаления [ 41 , 42 ]. Синтез ЦОГ-2 также, как ожидается, увеличится в ответ на УФ - облучении эпидермиса мыши [ 41 ]. Таким образом, мы тестировали, влияет ли Деринат на экспрессию ЦОГ-2 в клетках кожи? Как показано на фиг.7 , B, D, лечение Деринатом снижало экспрессию ЦОГ-2. УФ-В-индуцированная экспрессия TRPC7 также снизилась под влиянием Дерината (рис 7 Е). Деринат защищает клетки кожи от УФ-B-индуцированных повреждений ДНК мышей линии BALB / C-nu,  (рис 7 B). Для дальнейшего объяснения защитного эффекта Дерината повреждения ДНК  клеток кожи, мы взяли биопсию кожи, а затем экстрагируют геномную ДНК из нее, чтобы количественно определить процент повреждения ДНК с использованием набора II  HT 8-oxodG ELISA( Trevigen Inc., Gaithersburg, штат Мэриленд, США). Количественный анализ 8-oxodG отображённый на рисунке 7 , F, демонстрирует, что Деринат подавляет УФВ-индуцированное повреждения ДНК в зависимости от дозы. Результаты эксперимента in vivo показали, что Деринат эффективно уменьшает УФВ-индуцированное негативное воздействие на кожу такое как: шелушение, эпидермальную пролиферацию, внутриклеточную продукцию активных форм кислорода, повреждение ДНК и экспрессию ЦОГ-2 у мышей линии BALB / C-nu. Интересно отметить, что реакция кожных фибробластов на УФВ облучение не было столь велика, как в кератоцитах.

Рисунок 7. Влияние Деринат на УФB индуцированные повреждения кожи  у мышей линии BALB / C-nu. (A) На кожу был нанесён гидрогель с Деринатом  или чистый гидрогель на 3 ч, а затем она облучена УФВ с Е = 360 мДж / смІ. Через семь дней, на представленных фотографиях животных, УФВ-индуцированное шелушение есть на коже спины, но отсутствует в области живота. Средняя панель показывает увеличенное  изображение спинных областей; (B) Деринат защищает кожу мышей линии BALB / C-nu от УФB-индуцированной эпидермальной пролиферации, повреждения ДНК и экспрессии циклооксигеназы (ЦОГ) -2. Нормальную кожу и УФB облученную, покрытую гидрогелем с  Деринатом или чистым гидрогелем окрашивали ДНЕ и H & E (гематоксилином и эозином), а оксидативное повреждение ДНК 8-oxodG анализировали с помощью иммуногистохимического анализа со специфическим анти-8-oxodG мышиными моноклональными антителами. Экспрессия ЦОГ-2 в эпидермисе была обнаружена  с помощью моноклональное антител к ЦОГ-2 кролика; ( С, D ), количественное определение внутриклеточной синтеза АФК и уровня ЦОГ-2 , ( B ) представленное  в указанной области включает в себя как эпидермис и дерму без сальных желез ( * , р <0,05; ** , р <0,01; ** * , р <0,001). Деринат снижал уровень УФВ-индуцированную экспрессию каналов класса TRPC7 ( E ) и повреждение ДНК 8-oxodG ( F ) у мышей линии BALB / C-nu на основе ОТ-ПЦР и ELISA - анализа, соответственно ( * , р <0,05; ** , р <0,01).

Как показано на рисунке 2 , после воздействия УФВ-облучения повышение внутриклеточного Са 2+ в кератоцитах в семь раз выше, чем в кожных фибробластах. Аналогичная тенденция была также продемонстрирована в соотношении синтеза АФК и повреждения ДНК. Различия между кератоцитами и кожными фибробластами может быть связано с различиями во внутриклеточном повышении Ca 2+ в связи с различным распределением каналов TRPCs в кератоцитах и кожных фибробластах при процессах УФВ-индуцированного повреждения в коже.

3. Экспериментальный раздел

3.1. Культуры клеток.

Человеческие первичные кератиноциты (КЦ) и человеческие фибробласты кожи (КФ) были выделены из операционного материала полученного при циркумцизии (с одобрения совета Комитета по биомедицинской этике / этике (IRB), номер KMUH-IRB-960119), как описано ранее [ 43 , 44 ]. Если коротко, то образцы крайней плоти промывали с помощью фосфатно-солевого буфера (PBS) (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, США) и дезинфицировали 70%  спиртом. Материал измельчали ​​на мелкие кусочки. Чтобы изолировать КФ, небольшие кусочки дермы были погружены в раствор коллагеназы I типа  (3 мг / мл) (Sigma Chemicals Co.; Сент - Луис, штат Миссури, США) и тип IV коллагеназы IV типа  (3 мг / мл) (Sigma Chemicals Co.) при 37 С ° в течение 2 ч. Затем образцы инкубировали в 0,25% - ном растворе трипсина-ЭДТА (Gibco Invitrogen) при 37 ° С в течение 30 мин. Выделенные КФ выращивали в среде DMEM, модифицированной Dilbecco  Eagle's medium DMEM (Gibco Invitrogen), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при 37 С °  в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% СО2 в атмосфере. Чтобы изолировать КЦ, небольшие кусочки крайней плоти из образцов обрабатывали 1 ед / мл диспаза II (нейтральная протеаза) (Gibco  Invitrogen) при 4 C° в течение ночи. Эпидермис отделяли от крайней плоти образца и инкубировали в 0,25% растворе трипсина-ЭДТА при 37 °С в течение 15 мин. Выделенные КЦ культивировали в среде для кератиноцитов-SFM Eagle's medium (Gibco Invitrogen) при 37°С в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% СО2 в атмосфере. Среду меняли каждые 3 дня.

3.2. Анализ жизнеспособности клеток.

Клетки кожи, 2 Ч 10^5 КЦ или 1 Ч 10^5 КФ, были распространены на чашках диаметром 35 мм. Деринат (Technomedservis фармацевтическая компания, Мироновская, Россия) наносили после того, как клетки распространялись в посуде в течение 2 ч, а затем инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 . Клетки кожи были облучены Е = 50 мДж / см 2 для КЦ и Е = 100 мДж / см 2 для КФ лучами диапазона УФ-В  (источник УФ лучей 5 Ч 8 Вт, 312 нм; BLX-312, Vilber Lourmat, Франция) и заменяли нормальную среду для инкубирования каждые 24 ч. Соотношения выживших клеток кожи определяли с использованием 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2 Н - тетразолия (МТТ) (Sigma Aldrich, Сент - Луис, штат Миссури, США ) при 570 нм считывателем ELISA [ 45 ].