Автореферат «Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений» (стр. 2 )

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, включает 29 таблиц и 22 рисунка. Библиография насчитывает 231 наименование, из них 47 отечественных и 184 зарубежные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы

Устойчивые к тяжелым металлам бактерии выделяли из ризосферы растений, образцов почвы и промышленных сточных вод. В работе также использовали штаммы Comamonas из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (Пущино), ризосферные штаммы Pseudomonas и фитопатогенные грибы коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН (Пущино).

Культивирование бактерий проводили при 28°С на среде LB (Маниатис и др., 1984) и трис-минеральной среде (ТМС) (Мergeay et al., 1985). В качестве источника углерода и энергии добавляли глюкозу, глютамат натрия или нафталин. Соли металлов: CoCl2 × 6H2O, NiCl2 × 6H2O, CdSO4 × 8H2O, ZnSО4 × 7H2O, K2CrO4 добавляли в среду до конечных концентраций 0.005−10 мМ.

Конъюгационный перенос плазмид осуществляли согласно (Dunn and Gunsalus, 1973). Трансконъюгантные штаммы Pseudomonas отбирали на ТМС, содержащей 0.5 мМ кобальта или 1−2 мМ никеля.

Выделение плазмидной ДНК осуществляли методом щелочного лизиса (Birnboim and Doly, 1979).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе фирмы «Hybide» (Великобритания) в 20−50 мкл смеси по протоколу фирмы-производителя «Fermentas» (Литва). В ПЦР использовали разработанные нами праймеры, фланкирующие структурные гены оперона устойчивости к кобальту/никелю cnr плазмиды pMOL28 из C. metallidurans CH34: cnrCB Pf2350  (5'tgaaacaggtgatctcctcgttcc3') и Pr4850 (5' tcggcacagattctgtcaggcgt3'), cnrA Pf4800 (5'gtggactcgcaaactcatgcttcc3') и Pr8050 (5'ccgctgagaatgctctcgatcat3'). Использовали протоколы проведения ПЦР: для амплификации генов с плазмиды pMOL28 (контроль) : 1 цикл − 96°С 1 мин; 25 циклов − 95°С 30 с, 55°С 40 с, 72°С 2 мин 40 с; 1 цикл − 72°С 3 мин; для амплификации генов с плазмиды pBS501: 1 цикл − 96°С 1 мин; 2 цикла − 96°С 40 с, 42°С 40 с, 72°С 2 мин 40 с; 25 циклов − 95°С 30 с, 55°С 40 с, 72°С 2 мин 40 с; 1 цикл − 72°С 3 мин.

Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции EcoRI, HindIII, BamHI, PstI, SmaI проводили согласно протоколу, рекомендованному фирмой‑производителем («Fermentas», Литва).

Включение радиоактивной метки в рестрикционные фрагменты ДНК осуществляли с помощью DecalabelTM DNA labeling kit («Fermentas», Литва) по протоколу фирмы-изготовителя. В качестве зондов использовали [32P]-меченые фрагменты клонированных оперонов устойчивости czcCBAD, cnrXYHCBA, nccCB (плазмиды любезно предоставлены доктором Д. Нисом (D. H. Nies, Institute of Microbiology, Halle, Germany). Мечение ампликонов осуществляли во время ПЦР, добавляя в реакционную смесь [бP32]dATP. ДНК-ДНК гибридизацию проводили по методике, описанной (Sambrook et al., 2001).

Для амплификации и секвенирования фрагментов гена 16S рРНК использовали универсальные праймеры (Lane, (1991). ПЦР-фрагменты секвенировали на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, USA), используя набор реагентов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Beckman Coulter, USA). Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК анализировали с помощью пакетов программ BLAST (http://ncbi. nlm. nih. gov) и CLUSTAL W (http://www. genebee. /clustal). Построение филогенетического дерева производили методом neighbor-joining (NEIGHBOR), реализованным в пакете программ TREECON (Van de Peer et al., 1994).

Солюбилизацию поверхностных белков проводили 5 М хлоридом лития согласно методу (Lortal et al., 1992) с модификациями. Электрофорез белков проводили согласно (Laemmli, 1970).

Концентрацию кобальта в бактериальных клетках, выращенных в присутствии 0.25−2 мМ хлорида кобальта, определяли с помощью пламенной атомно-адсорбционной спектрофотометрии на приборе AAS-5100/Zeeman (Perkin-Elmer).

Ультратонкие срезы клеток бактерий готовили согласно методике (Reynolds, 1963) и просматривали в электронном микроскопе JEM 100B («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ, а негативно контрастированные клетки – при 60 кВ.

Удельные активности ферментов нафталиндиоксигеназы (Dua and Meera, 1981), салицилатгидроксилазы (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974), катехол-2,3-оксигеназы (Hegeman, 1966), катехол-1,2-оксигеназы (Feist and Hegeman, 1969) определяли в бесклеточных экстрактах клеток, выращенных в ТМС на нафталине (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля и без металла, на UV‑160А спектрофотометре (Shimadzu, Япония). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (Kalb and Bernlohr, 1977).

Концентрацию нафталина в среде определяли с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS-2 C18, Supelco (США). Разделение проводилось в градиенте: 1% уксусная кислота: (0−100%) метанол в течение 10 мин. Процент деградации нафталина определяли, учитывая его естественное испарение в контроле – среда с нафталином (1 г/л) без бактерий.

Вегетационные эксперименты, моделирующие загрязнение никелем, проводили в течение 4 недель на станции искусственного климата «Биотрон» (ФИБХ). Семена ярового ячменя сорта «Зазерский 85» инокулировали суспензией (108 клеток/мл) штаммов P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens BS1393(pBS501) и выращивали в сосудах, содержащих 400 г субстрата (торф : песок, 3 : 1 (pH 6.2)). Хлорид никеля вносили в концентрациях 235, 470 и 940 мг/кг. Через 2 недели определяли титр бактерий в ризосфере (КОЕ/см корня), в конце эксперимента массу растений и концентрацию никеля в корнях и надземной части растения. Эксперименты проводили в 8-кратной повторности.

Концентрацию никеля в растительных образцах определяли спектрофотометрически (СФ-26, λ=470 нм) с диметилглиоксимом в присутствии окислителя йодида калия согласно методике (Алимарин и Иванов, 1987). Концентрацию никеля рассчитывали в мг/кг сухой массы растений.

Вегетационные эксперименты, моделирующие смешанное загрязнение ПАУ и никелем проводили в течение 4 недель с естественным световым и температурным режимами. Семена сорго сорта «пищевое» и ячменя сорта «Зазерский 85» инокулировали суспензией (108 клеток/мл) штаммов-деструкторов ПАУ P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) и выращивали в сосудах, содержащих 400 г серой лесной почвы (рН 7.05). В качестве загрязнителей в почву вносили нафталин (1 г/кг) в варианте с сорго или смесь ПАУ (нафталин (1 г/кг) и фенантрен (0.2 г/кг)) в варианте с ячменем. Почву увлажняли раствором сульфата никеля (конечная концентрация 400 мг/кг). Через 4 недели определяли титр ризосферных бактерий и массу растений. Эксперименты проводились в 3‑ кратной повторности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и характеристика бактерий, устойчивых к никелю, кобальту, цинку, кадмию

На первом этапе работы проводили поиск бактерий, устойчивых к никелю, кобальту, цинку и кадмию, в ризосфере (1) дикорастущих растений заповедника (г. Владивосток), (2) культурных злаков, выращиваемых на сельскохозяйственной почве (г. Краснодар) и (3) диких злаков, собранных на заводской территории автозавода «СеАЗ» (г. Серпухов). Оказалось, что у ризосферных псевдомонад уровень устойчивости к никелю и цинку не превышал 2−3 мМ, кобальту − 0.5 мМ, кадмию − 0.2 мМ (кроме бактерий из 3 группы, которые были устойчивы к 2 мМ кадмия). Поэтому поиск высокорезистентных бактерий был продолжен в техногенно-загрязненных источниках: в почвах с территории нефтеперерабатывающего завода (г. Нижнекамск) и пробах промышленных сточных вод «Горьковского металлургического завода» (г. Нижний Новгород). Только в последних пробах были обнаружены бактерии, устойчивые к высоким концентрациям никеля/кобальта (3−8 мМ), цинка (3−5 мМ) и кадмия (2−3 мМ) (табл. 1).

Последующая задача состояла в обнаружении в этих бактериях плазмид, содержащих функциональные детерминанты устойчивости к тяжелым металлам, для переноса в известные штаммы PGPR Pseudomonas. Одним из эффективных механизмов, обеспечивающих высокий уровень устойчивости у бактерий, является быстрый экспорт тяжелых металлов с помощью мембранной помпы. Известны три типа оперонов, которые детерминируют этот механизм устойчивости: cnrXYHCBAT (Cor/Nir), czcCBADRSNI (Cor/Znr/Cdr) (Mergeay et al., 1985) и nccCBAYXHN (Nir/Cor/Cdr) (Schmidt and Schlegel, 1994). Фрагменты этих оперонов были использованы в качестве зондов для поиска гомологичных систем среди отобранных 42 штаммов со средним уровнем устойчивости к нескольким металлам. В табл. 1 представлены результаты положительной гибридизации, выявленные у 13 штаммов.

Таблица 1. Результаты гибридизации ДНК колоний выделенных устойчивых штаммов с зондами czcCBAD, cnrXYHCBAT и ncсСB

Штамм	Фенотип устойчивости 4	Гибридизация с зондами
czc	cnr	ncс
Ризосфера диких злаков («СеАЗ»)
Pseudomonas sp.1 R1	Ni(1) Zn(3) Cd(2)	+	−	−
Pseudomonas sp. R2	Ni(1) Zn (3) Cd(1)	+	−	−
Почва
Pseudomonas sp. S11	Ni(2) Zn(5) Cd(2)	±	−	−
Pseudomonas sp. S13	Ni(3) Zn(3) Cd(2)	±	−	−
Pseudomonas sp. S16	Zn(5) Cd(2)	±	−	−
Сточные воды
н. о.2 W27 (пл. 90 т. п.н.)	Co(8) Ni(8) Zn(1.5)	−	+	±
W283 (пл. 65 т. п.н.)	Co(8) Ni(8) Zn(2)	−	+	±
н. о. W29 (пл.10 т. п.н.)	Co(3) Ni(5) Zn(2)	−	+	±
н. о. W31	Co(5) Zn(3) Cd(3)	+	−	−
н. о. W32	Co(3) Zn(3) Cd(3)	+	−	−
н. о. W33	Co(3) Zn(5) Cd(3)	+	−	−
н. о. W37 (пл. 5 т. п.н.)	Co(5) Ni(5) Cd(2)	−	−	+
н. о. W38 (пл. 5 т. п.н.)	Co(5) Ni(3) Cd(2)	−	−	+
Контроли
E. coli EC246 (cnrXYHCBA:pSUP202)	−	+	−
E. coli EC115 (czcCBAD:pT7-5)	+	−	−
E. coli EC767 (nccCB:pVDZ'2)	−	−	+

Примечания: 1 На основании морфо-физиологических признаков изолят отнесен к Pseudomonas sp.; 2 н. о. – не определен до рода; 3 изолят W28 (лабораторный номер BS501(pBS501)) в дальнейшем идентифицирован как Comamonas testosteroni. Штаммы, выделенные из ризосферы (R), почвы (S), воды (W). 4 В скобках указана максимальная концентрация металла (мМ) в среде LB, при которой наблюдается рост штамма. (−) Отсутствие сигнала, (+) сильный, (±) слабый сигналы гибридизации.