Автореферат «Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений» (стр. 4 )

В ходе работы выявлено, что большинство видов фитопатогенных грибов родов Fusarium, Rhizoctonia или Geumanomyces обладает более высоким уровнем устойчивости к кобальту и никелю, чем исследуемые ризосферные бактерии. Однако ризосферные штаммы, содержащие плазмиду pBS501, при совместном выращивании с различными видами перечисленных фитопатогенов, подавляли рост грибов в присутствии 2 мМ кобальта или никеля, в отличие от исходных штаммов. На рис. 6 показан пример супрессии Fusarium oxysporum устойчивыми штаммами P. aureofaciens BS1393(pBS501), P. fluorescens 38a(pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS501) (1−3) при совместном выращивании в присутствии 2 мМ никеля. В то же время чувствительные варианты BS1393 (4) и 38a (5) слабее подавляли рост гриба, а штамм PCL1391 (6) зарастал грибным мицелием.

Рис. 6. Супрессия Fusarium oxysporum ризосферными штаммами при совместном выращивании в присутствии 2 мМ никеля: (1) P. aureofaciens BS1393(pBS501), (2) P. fluorescens 38a(pBS501), (3) P. chlororaphis PCL1391(pBS501); (4) BS1393, (5) 38a, (6) PCL1391.

3.3 Аккумуляция кобальта устойчивыми штаммами. На основе штамма P. aureofaciens BS1393 разработан и широко применяется биопрепарат для защиты и стимуляции роста растений «Псевдобактерин-2» (Боронин, Кочетков, 1995). В связи с загрязнением почв тяжелыми металлами необходимо было выяснить возможность использования устойчивого варианта BS1393(pBS501) на загрязненных почвах. Было показано, что при выращивании P. aureofaciens BS1393(pBS501) и C. testosteroni BS501(pBS501) в среде, содержащей от 0.25 до 2 мМ хлорида кобальта, в клетках штаммов увеличивалось содержание кобальта (табл. 3).

Таблица 3. Аккумуляция кобальта штаммами C. testosteroni BS501(pBS501) и P. aureofaciens BS1393(pBS501)

Концентрация Со2+ в среде, мМ (мкг Со/мл)*	Со, мкг/мг сухой биомассы	Сухая биомасса, мг/мл культуры	% аккумуляции	Со, мкг/мг сухой биомассы	Сухая биомасса, мг/мл культуры	% аккумуляции
C. testosteroni BS501(pBS501)	P. aureofaciens BS1393(pBS501)
0.25 (14.7)*	0.11±0.02	4.0±0.1	3	0.69±0.03	3.7±0.4	17
0.5 (29.4)	0.34±0.03	3.8±0.2	4	1.49±0.01	3.5±0.3	17
1.0 (58.9)	0.51±0.01	3.8±0.2	3	2.34±0.02	3.0±0.1	12
1.5 (88.4)	0.91±0.01	3.6±0.1	3	3.14±0.02	2.5±0.1	9
2.0 (117.8)	0.86±0.03	3.5±0.1	2	3.54±0.01	2.5±0.2	7

Из данных табл. 3 видно, что ризосферный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) аккумулировал в 3−6 раз больше металла по сравнению со штаммом C. testosteroni BS501(pBS501). При концентрации кобальта в среде до 0.5 мМ через 18 часов роста в биомассе ризосферного штамма наблюдалась максимальная аккумуляция − до 17%. При субингибирующей концентрации металла в среде (2 мМ) его аккумуляция понижалась до 7%. Штамм C. testosteroni BS501(pBS501), имеющий более высокий уровень устойчивости (5 мМ), аккумулировал не более 4%.

3.4 Локализация кобальта в клетках. На поверхности клеток устойчивых штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS501) (рис. 7а) и C. testosteroni BS501(pBS501) (рис. 7б), выращенных в присутствии кобальта, обнаружены электронно-плотные гранулы и кристаллиты, соответственно.

(а)	(б)
(в)	(г)

Рис. 7. Ультратонкие срезы клеток P. aureofaciens BS1393(pBS501) (а), C. testosteroni BS501(pBS501) (б), P. aureofaciens BS1393 (в), выращенных в присутствии 2 мМ кобальта, и P. aureofaciens BS1393(pBS501) (г), выращенных в среде без кобальта. Стрелками указаны электронно-плотные структуры в виде гранул (а, в) и кристаллитов (б). Шкала 0.5 мкм.

В чувствительном штамме P. aureofaciens BS1393 гранулы были обнаружены не только на поверхности клеток, но также в цитоплазме и периплазматическом пространстве клеток (рис. 7в), что может объясняться отсутствием у данного штамма системы вывода токсичных катионов. Возможно, что гранулы в клетках P. aureofaciens BS1393 и BS1393(pBS501) представляют собой конгломераты связанных с кобальтом клеточных метаболитов, например, сидерофоров, феназиновых производных или экзополисахаридов, которые синтезируются во время роста штаммов. В пользу этого предположения свидетельствует отсутствие гранул после инкубации отмытых клеток в среде с кобальтом, хотя в этом случае клетки накапливали до 2 мкг Со/мг биомассы.

4. Ризосферный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем

Известно, что соли никеля более токсичны для растений, чем соли кобальта (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Поэтому в вегетационных экспериментах c растениями ячменя исследовали способность штамма P. aureofaciens BS1393(pBS501) защищать растения от аккумуляции никеля. Никель вносили в торфосмесь в концентрациях 235, 470 и 940 мг/кг, что согласно гигиеническим нормативам соответствует примерно 2.5, 5 и 10 ПДК валового содержания никеля. Предварительные эксперименты показали, что при данных концентрациях никель оказывает негативное влияние как на рост ячменя, так и на численность бактерий в ризосфере.

4.1 При загрязнении 235 мг никеля/кг торфосмеси (2.5 ПДК) устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) обладал численным преимуществом в ризосфере ячменя по сравнению с бесплазмидным вариантом P. aureofaciens BS1393. Через 2 недели роста растений численность устойчивого штамма в ризосфере (6.2×108 КОЕ/см корня) была на два порядка выше численности чувствительного штамма BS1393 (5.4×106 КОЕ/см корня). Очевидно, это преимущество и обеспечило бульшую стимуляцию роста растений (рис. 8).

Рис. 8. Развитие растений ячменя при уровне загрязнения никелем 2.5 ПДК (1, 3, 4); 1 – растения без инокуляции; 3 и 4 – растения инокулированы штаммами P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens BS1393(pBS501), соответственно; 2 – растения без инокуляции, выращенные в чистом субстрате.

При сравнении массы инокулированных и контрольных растений было показано, что даже в условиях загрязнения никелем чувствительный штамм P. aureofaciens BS1393 обеспечивал увеличение массы корней в 2.5 раза и надземной части растений на 30%. Однако устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) более эффективно стимулировал рост растений: обеспечивал прирост массы корней в 4.5 раза и надземной части растений на 48% (табл. 4). В среднем общая масса растения, инокулированного P. aureofaciens BS1393(pBS501), была на 40% больше массы растения, инокулированного P. aureofaciens BS1393. При этом плазмидосодержащий штамм, по сравнению с исходным штаммом, обеспечивал двукратное увеличение массы корней и на 14% − надземной части растений.

Таблица 4. Влияние PGPR Pseudomonas на массу ячменя и аккумуляцию никеля в растениях при содержании 235 мг Ni/кг торфосмеси (2.5 ПДК)

Обработка семян	Надземная часть	Корни	Целое растение
сухая масса, мг
Без инокуляции	65±3	18±4	83
P. aureofaciens BS1393	84±2	43±2	127
P. aureofaciens BS1393(pBS501)	96±3	80±3	176
концентрация Ni, мг/кг сухой массы
Без инокуляции	30±5	46±5	38±5
P. aureofaciens BS1393	100±15	330±20	177±17
P. aureofaciens BS1393(pBS501)	80±10	108±15	92±12
Без инокуляции в чистом субстрате	78±4	38±3	116

Помимо стимулирующего эффекта на растения, инокуляция семян ячменя устойчивым штаммом способствовала снижению токсического воздействия никеля на растения и уменьшению аккумуляции металла в растительных тканях. Как видно из данных табл. 4, в корнях растений, инокулированных плазмидосодержащим штаммом, концентрация никеля (108 мг никеля/кг сухой массы растений), была в 3 раза меньше, чем в корнях растений, инокулированными исходным штаммом (330 мг никеля/кг массы растений). В надземной части растений содержание никеля было сравнимо при обоих вариантах инокуляции (80−100 мг никеля/кг массы растений) (табл. 4). Поскольку в ризосфере растений численность устойчивого штамма была значительно выше численности чувствительного, возможно, именно это способствовало большей иммобилизации никеля бактериями и уменьшению концентрации свободных катионов в зоне всасывания корней.

4.2 При загрязнении 470 мг никеля/кг торфосмеси (5 ПДК) через 2 недели роста растений было отмечено уменьшение численности интродуцированных бактерий в ризосфере (до 105 КОЕ/см корня) и отсутствие стимулирующего влияния на массу растений (табл. 5). Однако, даже при такой низкой численности клеток содержание никеля в корнях растений, инокулированных штаммом P. aureofaciens BS1393(pBS501) (1110 мг никеля/кг массы растений), было на 30% меньше, чем в растениях, инокулированных исходным штаммом (1490 мг никеля/кг массы растений) (табл. 5).