Автореферат «Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений» (стр. 5 )

Таблица 5. Влияние PGPR Pseudomonas на массу ячменя и аккумуляцию никеля в растениях при содержании 470 мг Ni/кг торфосмеси (5 ПДК)

Обработка семян	Надземная часть	Корни	Целое растение
сухая масса, мг
Без инокуляции	62±2	18±1	80
P. aureofaciens BS1393	65±2	16±2	81
P. aureofaciens BS1393(pBS501)	69±3	19±2	88
концентрация Ni, мг/кг сухой массы
Без инокуляции	130±20	940±40	535±30
P. aureofaciens BS1393	160±20	1490±120	825±70
P. aureofaciens BS1393(pBS501)	160±15	1110±80	635±45
Без инокуляции в чистом субстрате	78±4	38±3	116

В надземной части растений, инокулированных как устойчивым, так и чувствительным штаммами, содержание никеля было одинаковым (160 мг никеля/кг массы растений) (табл. 5). Однако, как видно из рис. 9, штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) защищал растения от токсического воздействия никеля. При инокуляции устойчивым штаммом количество растений с признаками хлороза (обесцвечивания листьев) на протяжении 4-х недель роста увеличивалось не так стремительно (от 7 до 50%), как при инокуляции исходным штаммом (от 20 до 80%) или в вариантах без инокуляции (от 17 до 80%) (рис. 9).

Рис 9. Влияние инокуляции семян ячменя ризосферными штаммами P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens BS1393(pBS501) на развитие хлороза у растений, выращенных при загрязнении 470 мг Ni/кг субстрата.

4.3 При загрязнении 940 мг никеля/кг торфосмеси (10 ПДК) численность штаммов через 2 недели роста была очень низкой (3.2–4.7 × 102 КОЕ/см корня), и ризосферные бактерии не стимулировали рост растений. Только в течение первой недели роста устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) обеспечивал защиту растений от токсического действия никеля (29% пораженных растений), в то время как 65% растений, инокулированных чувствительным штаммом, имели признаки хлороза.

5. Устойчивые к кобальту/никелю PGPR Pseudomonas-деструкторы ПАУ

5.1 Получение двухплазмидных штаммов. Одним из перспективных подходов для биоремедиации почв со смешанными загрязнениями тяжелыми металлами и органическими токсикантами является применение устойчивых к тяжелым металлам штаммов-деструкторов (Weyens et al., 2010, 2011). В настоящей работе плазмида pBS501 с помощью трансформации была перенесена в штаммы P. aureofaciens BS1393, P. chlororaphis PCL1391 и P. fluorescens 38a, содержащие природную плазмиду биодеградации нафталина/фенантрена pBS216. В полученных трансформантах визуализированы две плазмиды размером около 65 и 85 т. п.н., соответствующие по размеру pBS501 (65 т. п.н.) и pBS216 (85 т. п.н.) (рис. 10).

Рис. 10. Электрофореграмма тотальной ДНК в 0.8% агарозном геле: (1) pBS216; (2) pBS501; двухплазмидные штаммы (3) BS1393(pBS216,pBS501); (4) PCL1391(pBS216,pBS501), (5) 38a(pBS216,pBS501).

Кроме того, наличие гена cnrA плазмиды pBS501 и гена nahAc нафталинового оперона плазмиды pBS216 в полученных рекомбинантных штаммах подтверждалось с помощью ПЦР, результаты которой представлены на рис. 11.

Рис. 11. Электрофореграмма результатов ПЦР гена cnrA (а) и nahAc (б):  (2) BS1393(pBS216,pBS501), (3)  PCL1391(pBS216,pBS501), (4) 38a(pBS216,pBS501); (а) (1) «–» контроль BS1393(pBS216), (5) «+» контроль cnrXYHCBA:pSUP202; (б) (1) «+» контроль BS1393(pBS216), (5) «–» контроль BS1393(pBS501; М – маркер.

Уровни устойчивости к кобальту и никелю при росте реципиентных штаммов на нафталине не превышали 50 и 100 мкМ, соответственно. У трансформантов P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501), P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) и P. fluorescens 38a(pBS216,pBS501) уровни устойчивости повышались в 4–8 раз к кобальту и в 2–4 раза к никелю и составили 200–400 мкМ, однако были ниже, чем уровни устойчивости штаммов, выращенных на глюкозе или глютамате, (табл. 2).

5.2 Активности ключевых ферментов биодеградации нафталина

Известно, что тяжелые металлы ингибируют ферменты клеточного метаболизма, в том числе и специфические оксигеназы (Sandrin, 2003). При выращивании полученных нами рекомбинантных штаммов на нафталине в присутствии 100 мкМ никеля, вплоть до стационарной фазы роста сохранялись высокие активности ключевых ферментов биодеградации нафталина нафталиндиоксигеназы, салицилатгидроксилазы, катехол-2,3-диоксигеназы, кодируемых плазмидой pBS216, и катехол-1,2-диоксигеназы, кодируемой хромосомой штаммов (табл. 6). Из данных, представленных в табл. 6, видно, что у чувствительных штаммов BS1393(pBS216) и PCL1391(pBS216) активности исследуемых ферментов понижались почти на порядок, а в штамме 38a(pBS216) не регистрировались.

Таблица 6. Удельная активность ключевых ферментов биодеградации нафталина у ризосферных штаммов-деструкторов, выращенных до стационарной фазы роста на нафталине в присутствии 100 мкМ никеля

Штамм	Удельная активность ферментов, нмоль/мин мг белка
НО	СГ	К1,2О	К2,3О
BS1393(pBS216,pBS501)	7	30	63	14
BS1393(pBS216)	0.3	4.3	7.4	25
PCL1391(pBS216,pBS501)	1.6	36.8	55.3	1.2
PCL1391(pBS216)	0.2	4.1	7.5	27.4
38a(pBS216,pBS501)	2	62	28	18
38a(pBS216)	н. о.	н. о.	н. о.	н. о.

Примечания: н. о. – активность не определяется. НО − нафталиндиоксигеназа, СГ − салицилатгидроксилаза, К2,3О − катехол-2,3-диоксигеназа, К1,2О − катехол-1,2-диоксигеназа.

Ранее ингибирующее влияние никеля и цинка на деградацию хлоробифенилов исследовали при высокой плотности культуры устойчивых штаммов-деструкторов (Springael et al., 1993). В настоящей работе влияние никеля (100 мкМ) на биодеградацию нафталина (1 г/л) оценивалось во время роста культуры с низкой плотностью заражения (107 КОЕ/мл), при этом нафталин использовался как единственный источник углерода. Устойчивые штаммы-деструкторы P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) менее чем за сутки культивирования в присутствии 100 мкМ никеля достигали численности бактерий 108 и 1010 КОЕ/мл, соответственно, и окисляли почти весь нафталин (табл. 7). Численность чувствительных штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. chlororaphis PCL1391(pBS216) (5.0 × 106 и 7.0 Ч 107 КОЕ/мл, соответственно); в течение 1.5 суток почти не возрастала, а биодеградация нафталина составила около 10% (табл. 7).

Таблица 7. Биодеградация нафталина (1 г/л) ризосферными штаммами-деструкторами при культивировании в присутствии 100 мкМ никеля

Варианты	КОЕ/мл	Концентрация нафталина в среде, мг/л	% деградации
21 ч	36 ч
Контроль испарения нафталина	среда без бактерий	870.0 ± 22.0	191.0 ± 40.0	-
PCL1391(pBS216,pBS501)	1.2 Ч 1010	9.0 ± 0.1	не определяли	98
BS1393(pBS216,pBS501)	1.0 × 108	12.0 ± 0.2	не определяли	98.6
PCL1391(pBS216)	7.0 Ч 107	но	168.0 ± 17.0	12
BS1393(pBS216)	5.0 × 106	но	170.0 ± 16.0	10

5.3 Стабильность плазмид. Успешность использования штаммов, содержащих плазмиды с целевыми функциями, в полевых условиях зависит от стабильности этих плазмид. После 10 пассажей штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) и P. fluorescens 38a(pBS216,pBS501) в неселективных условиях стабильность обеих плазмид составила 50 и 35%, соответственно, тогда как в штамме P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) обе плазмиды сохранялись в 100% клеточной популяции.

6. Рекомбинантный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в вегетационных экспериментах, моделирующих смешанное загрязнение

В настоящей работе было показано, что устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) стимулирует рост растений, выращиваемых в условиях загрязнения никелем. Поэтому было важно выяснить, сохраняет ли эту способность двухплазмидный вариант этого штамма P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в условиях смешанного загрязнения ПАУ и никелем (см. Материалы и методы). Показано, что в отсутствие никеля численность как чувствительного BS1393(pBS216), так и устойчивого BS1393(pBS216,pBS501) штаммов в ризосфере сорго (при загрязнении нафталином) и ячменя (при загрязнении нафталином и фенантреном) была одинаковой (~104 Ч КОЕ/см корня). При этом инокулированные растения имели бьльшую массу, чем растения без инокуляции (табл. 8).

Однако в условиях смешанного загрязнения численность устойчивого штамма-деструктора P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в ризосфере (2.4 Ч 104 и 5.2 Ч 105 КОЕ/см корня сорго и ячменя, соответственно) была на порядок выше численности чувствительного штамма BS1393(pBS216) (4.0 Ч 103 и 1.3 Ч 104 КОЕ/см корня сорго и ячменя, соответственно). При инокуляции семян устойчивым штаммом наблюдалось увеличение массы сорго и ячменя на 70 и 57%, соответственно, по сравнению с массой не инокулированных растений. Тогда как инокуляция чувствительным штаммом BS1393(pBS216) только на 25% увеличивала массу сорго и не стимулировала рост ячменя (табл. 8).