Автореферат «Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений» (стр. 3 )

Как видно из табл. 1, у пяти ризосферных и почвенных псевдомонад выявлена гомология с зондом czcCBAD, однако эти штаммы были чувствительны к никелю и не содержали плазмид. У восьми штаммов, выделенных из сточной воды, выявлены сигналы гибридизации с зондами czcCBAD (3 штамма), ncсСB (2 штамма) и одновременно с двумя зондами cnrXYHCBAT/ncсСB (3 штамма). Только в этой группе бактерий обнаружены 5 плазмидосодержащих штаммов.

2. Характеристика детерминанты устойчивости к кобальту/никелю в штамме Comamonas testosteroni BS501(pBS501)

2.1 Плазмидная локализация. Наибольший интерес для дальнейших исследований представлял выделенный из пробы сточной воды штамм W28, (лабораторный номер BS501(pBS501)) устойчивый к 5 мМ кобальта, 5 мМ никеля и 2 мМ цинка. В штамме обнаружена плазмида pBS501 размером около 65 т. п.н. (рис. 1, дорожка 1), которая передавалась при конъюгации в чувствительные штаммы P. putida BS394 и W340 с частотой 10–6 и обеспечивала устойчивость только к 2 мМ кобальта и никеля. Из данных Таблицы 1 видно, что при гибридизации ДНК колоний штамма BS501(pBS501) были выявлены 2 сигнала – сильный с зондом cnr и слабый с зондом ncc. Однако, гибридизация EcoRI-, HindIII - и SalI-фрагментов рестрикции ДНК pBS501 с этими зондами выявила только один положительный сигнал с опероном cnrXYHCBA, локализованным на плазмиде pMOL28.

Рис. 1. Электрофорез плазмидных ДНК из штаммов: (1) W28 (BS501(pBS501)) (65 т. п.н.), (2) W29 (90 т. п.н.); маркерные плазмиды: (3) pMG18 (102 т. п.н.), (4) pBS216 (85 т. п.н.), (5) pULB113 (68 т. п.н.).

2.2 Идентификация штамма BS501(pBS501). До настоящего времени обнаружены только три плазмиды, содержащие функциональные детерминанты устойчивости: pMOL28 (cnr) и pMOL30 (czc) в Cupriavidus metallidurans CH34 (Mergeay et al., 1985) и pTOM9 (ncc) в C. metallidurans 31a (Schmidt and Schlegel, 1994). Плазмида pBS501 (65 т. п.н.) в отличие от pMOL28 (180 т. п.н.), значительно меньшего размера и не детерминирует устойчивость к хромату и ртути. Поэтому несомненный интерес представляло выяснение таксономического положения штамма BS501(pBS501). По совокупности морфологических, физиолого-биохимических признаков и по результатам сравнительного анализа последовательности гена 16S рибосомальной РНК штамм BS501(pBS501) отнесен к роду Comamonas (класс Betaproteobacteria, порядок Burkholderiales, семейство Comamonadaceae), и идентифицирован как Comamonas testosteroni (рис. 2). В бактериях рода Comamonas описаны плазмиды, несущие гены биодеградации толуолсульфоната, сульфобензоата, хлоро - и нитробензенов, фталатов и других токсичных ксенобиотиков (Tralau et al., 2001; Wu, et al., 2006). Хотя в геномах бактерий порядка Burkholderiales выявлены последовательности, гомологичные cnr и ncc (Stoppel and Schlegel, 1995), их исследование не проводилось, и плазмиды, контролирующие устойчивость к двухвалентным катионам, в Comamonas до настоящего времени не были обнаружены.

Рис. 2. Положение штамма Comamonas testosteroni BS501(pBS501) на филогенетическом дереве порядка Burkholderiales (класс Betaproteobacteria) на основании последовательности гена 16S рРНК. Масштаб (0.01) соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью «bootstrap-анализа» 1000 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы TREECON.

Праймеры, фланкирующие структурные гены cnrCB и cnrA оперона cnr плазмиды pMOL28, были использованы в ПЦР с плазмидной ДНК pBS501. Различия, обнаруженные в спектре и размерах ампликонов, свидетельствуют о том, что исследуемая детерминанта отличается от оперона cnr (рис. 3а, дорожки 4, 5). В то же время, положительная гибридизация с зондами cnrCB (рис. 3б, дорожка 4) и cnrA (рис. 3в, дорожка 5) указывает на их значительную гомологию.

Рис. 3. Выявление гомологии детерминанты устойчивости к кобальту/никелю плазмиды pBS501 с 32Р-меченными ампликонами cnrCB (б) и cnrА (в). (а) Электрофореграмма: 1 − λHindIII; 2 и 3 − ампликоны cnrCB и cnrА, соответственно, с плазмиды cnrXYHCBA:pSUP202 («+» контроли); 4 и 5 − ампликоны «cnrCB» и «cnrА», соответственно, с плазмиды pBS501.

2.3 Индукция устойчивости к кобальту/никелю. Экспрессия оперона cnr в C. metallidurans CH34 индуцируется катионами кобальта и никеля (Schmidt and Schlegel, 1994). Предварительное выращивание инокулята штамма C. testosteroni BS501(pBS501) при 10−200 мкМ никеля или кобальта с первых часов обеспечивало быстрый рост культуры в среде, содержащей 2 мМ кобальта или никеля (рис. 4, кривые 1, 2), тогда как в вариантах без индукции наблюдалась продолжительная лаг-фаза (4−6 ч) (рис. 4, кривая 3). Из рисунка видно, что катионы цинка и кадмия не являются индукторами устойчивости (рис. 4, кривые 4 и 5).

Рис. 4. Влияние индукции системы устойчивости катионами тяжелых металлов на рост C. testosteroni BS501(pBS501) в присутствии 2 мМ никеля. Инокулят выращивали при: (1) 20 мкМ Ni, (2) 50 мкМ Со, (4) 200 мкМ Zn, (5) 50 мкМ Cd, (3) без индукции.

2.4 Устойчивость цитоплазматической мембраны клеток исходного штамма C. testosteroni BS501(pBS501) и трансконъюганта P. putida BS394(pBS501) к воздействию кобальта

С помощью метода электроориентационной спектроскопии (ЭОС) (Мирошников и др., 1986) показано, что цитоплазматическая мембрана (ЦМ) клеток C. testosteroni BS501(pBS501) и трансконъюганта P. putida BS394(pBS501), инкубированных в присутствии 50−200 мкМ кобальта, подвергается лишь незначительному повреждению. Так, при 100 мкМ кобальта для клеток C. testosteroni BS501(pBS501) и P. putida BS394(pBS501) величина Δβ/βк, характеризующая степень повреждения ЦМ, составила −0.13±0.05 и −0.15±0.05, соответственно, тогда как для чувствительного штамма P. putida BS394 Δβ/βк = −0.48±0.2. После мягкой обработки клеток штамма C. testosteroni BS501(pBS501) трипсином степень повреждения его ЦМ при воздействии 100 мкМ кобальта увеличивалась до −0.54±0.1, что может указывать на наличие защитных белков на поверхности клеток C. testosteroni BS501(pBS501). С поверхности клеток штаммов C. testosteroni BS501(pBS501) и P. putida BS394(pBS501) 5 М хлоридом лития солюбилизировались белки массой около 49, 40 и 32 кДа, которые отсутствовали у чувствительного штамма P. putida BS394 (рис. 5). Обнаруженные белки оказались близки по массе белкам, кодируемым сnr-опероном из C. metallidurans CH34: CnrC (44 кДа), CnrB (40 кДа) и CnrT (37 кДа) (Liesegang et al., 1993).

Рис 5. Электрофореграмма белков, солюбилизированных 5 М хлоридом лития с поверхности клеток устойчивых штаммов, в 9% ПААГ-ДСН: (1) белковые маркеры (кДа), (2) P. putida BS394, (3) C. testosteroni BS501(pBS501), (4) P. putida BS394(pBS501).

Измерения ЭОС клеток проводились при 20°С через 15 мин после внесения в бактериальную суспензию кобальта. Поэтому обнаруженные поверхностные белки могли участвовать в процессах экспорта катионов тяжелых металлов из клеток исследуемых устойчивых бактерий, однако не исключено также их участие в биосорбции и иммобилизации металлов.

3. Характеристика штаммов PGPR Pseudomonas, содержащих плазмиду pBS501

3.1 Получение устойчивых вариантов PGPR. Плазмида pBS501 с помощью конъюгации была перенесена в ризосферные штаммы P. aureofaciens BS1393, P. fluorescens 38a и P. chlororaphis PCL1391. С частотой 10−4−10−5 получены трансконъюганты, в которых плазмида стабильно сохраняется в неселективных условиях, как минимум, в течение 10 пассажей и обеспечивает повышение устойчивости к кобальту (0.5−2.0 мМ) от 5 до 20 раз, и никелю (1.0−2.5 мМ) от 2 до 10 раз (табл. 2).

Таблица 2. Уровни устойчивости к тяжелым металлам штаммов Pseudomonas и Comamonas в трис-минеральной среде с глютаматом натрия или глюкозой

Штаммы	Максимальный уровень устойчивости (мМ)
Co	Ni	Zn	Cd
P. aureofaciens BS1393	0.1	1.0	1.5	0.2
P. aureofaciens BS1393(pBS501)	2.0	2.0	1.5	0.2
P. chlororaphis PCL1391	0.05	0.15	2.5	0.2
P. chlororaphis PCL1391(pBS501)	0.5	2.0	2.5	0.2
P. fluorescens 38a	0.05	0.1	2.0	0.1
P. fluorescens 38a(pBS501)	0.5	1.0	2.0	0.1
C. testosteroni B-1241	0.5	1.0	1.0	0.1
C. testosteroni B-1241(pBS501)	5.0	5.0	1.0	0.1
C. acidovorans B-1251	1.0	2.0	1.0	0.2
C. acidovorans B-1251(pBS501)	5.0	5.0	1.5	0.2
C. testosteroni BS501(pBS501)	5.0	5.0	1.0	0.1

3.2 Супрессия фитопатогенов и продукция индольных соединений ризосферными штаммами в присутствии кобальта/никеля. Исходные ризосферные штаммы являются продуцентами фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и противогрибных антибиотиков – феназинов (P. aureofaciens BS1393), пиолютеорина (P. fluorescens 38a) и феназинкарбоксамида (P. chlororaphis PCL1391). Известно о положительном влиянии микромолярных концентраций тяжелых металлов на синтез ИУК (Belimov et al., 2000, Белимов, 2008) и некоторых антибиотиков (Slininger and Jackson, 1992; Chin-A-Woeng et al., 1998 Duffy and Defago, 1999). В настоящей работе показано, что в культуральной среде устойчивых штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS501), выращенных в присутствии 2 мМ никеля или кобальта, концентрация индольных соединений (1.6−2.0 мкг/мг биомассы) в 1.5−2 раза выше по сравнению с чувствительными вариантами.