Методическая разработка по теме: «Питательные среды» (стр. 2 )

Классификация питательных сред по назначению:

1. Универсальные (пептонная вода, МПА, МПБ) - подходят для культивирования большинства микроорганизмов.

2. Элективные (кровяной агар, желточно-солевой агар, крахмальная среда, Китта-Тароцци, Эшби) – предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания, обеспечивают развитие определенной группы бактерий, для которой характерна общность физиологических свойств.

3. Дифференциально-диагностические – индикаторные (ЭНДО, Плоскирева, Клиглера), среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности.

Пример: на среде ЭНДО колонии E. coli образуют малиновые колонии с металлическим блеском (лактоза + ) или без него (лактоза - ).

4. Консервирующие (глицериновая смесь) предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала, в них предотвращается гибель патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов.

Требования, предъявляемые к питательным средам:

1. Питательными – содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей бактерий.

2. оптимальное рН – концентрация водородных ионов, только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. Норма (рН 7,2-7,4) исключение холерный вибрион (рН 8,5-9,0) и возбудитель туберкулеза (рН 6,2-6,8), продукты жизнедеятельности бактерий могут изменять рН поэтому необходимо добавлять вещества которые будут их нейтрализовать (буферность).

3. Изотоничность – осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки в норме соответствует 0,5% раствору натрия хлорида.

4. Стерильность – посторонние микроорганизмы препятствуют росту исследуемой культуры.

5. Влажность – характерно для плотных питательных сред.

6. Окислително-восстановительный потенциал – соотношение веществ отдающих и принимающих электроны, этот потенциал (RH2) показывает насыщение среды кислородом.

Пример: анаэробы размножаются при (RH2) не выше 5, а аэробы - при (RH2) не ниже 10.

7. Прозрачность – удобно наблюдать за ростом микроорганизмов.

Универсальные плотные питательные среды

Мясо-пептонный агар (МПА) - плотная или полужидкая универсальная питательная среда, состоящая из мясо-пептонного бульона с добавлением 0,5—2% агара и применяемая для выращивания большинства патогенных микроорганизмов.

Основой для приготовления МПА является мясная вода, к которой прибавляют 1% порошкообразного пептона и 0,5% поваренной соли и растворяют при подогревании. Для полного осаждения белков жидкость кипятят, постоянно помешивая, в течение 30 мин. или выдерживают 20 мин. в автоклаве при t 115°С. После этого фильтруют через 3—4 слоя фильтровальной бумаги, предварительно смоченной дистиллированной водой, устанавливают реакцию среды (рН не ниже 8,2—8,4) и добавляют 0,5—2% (в зависимости от необходимой степени плотности среды) размельченного и промытого агара, после чего жидкость нагревают, медленно помешивая, до полного растворения агара. При упаривании добавляют горячую дистиллированную воду до первоначального объема. После растворения агара проверяют реакцию среды, окончательно устанавливают требуемую величину рН (обычно 7,2—7,3) и, если необходимо, фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат разливают в пробирки, флаконы, колбы и стерилизуют в автоклаве при t 120°С в течение 20—30 мин. После стерилизации среда, остывая, уплотняется.

Источником азота являются органические соединения, находящиеся в мясной воде, и некоторые продукты протеолиза белков — пептоны, представляющие собой смесь полипептидов (зачастую довольно сложных), дипептидов различных аминокислот.

МПА содержит 0,4% общего азота, 0,07% аминного азота, 4,6% сухого остатка, 1,4% зольных элементов и 0,85% хлоридов.

При остывании агаризованной среды образуется конденсационная вода, для получения изолированных колоний чашки Петри помещают в термостат крышками вниз. В противном случае на внутренней стороне крышки скапливается конденсат, который стекая на поверхность среды мешает получению изолированных колоний.

МПА с добавлением определенных компонентов (крови, сыворотки, яичного желтка и т. п.) употребляется для культивирования некоторых патогенных микроорганизмов, плохо растущих или совсем не растущих на обычных питательных средах.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ) – этот экстракт получают из субстратов богатых коллагеном – белком костей, хрящей, чешуи. Образуемый желатинной гель плавится при температуре 250С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (370С). Кроме того желатина разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатины ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Желатину используют в диагностических целях – для выявления протеолитической активности, а также для получения глубинных колоний дрожжей.

К жидким средам добавляют 10-20% желатины, оставляют набухать 5-10 мин. И нагревают на водяной бане до растворения. Доводят рН среды до 6,8-7,0. Желатина имеет кислую реакцию и обладает большой буферностью, на нейтрализацию идет больше щелочи, чем на МПА. Желатиновые среды стерилизуют при 0,5 А 15 мин или дробно 3 раза по 20 мин. в аппарате Коха. Повторная стерилизация желатиновых сред особенно при рН ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, так как желатина частично гидролизуется и теряет гелеобразующие свойства.

Универсальные жидкие питательные среды

Мясо-пептонный бульон (МПБ) – сухой порошок, состоящий из гидролизата мяса и NаCl. 500 г мяса освобожденного от костей заливают 1 л водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 часов или в термостат при 300С на 6 часов. За это время из мяса эстрагируются различные вещества, в том числе водорастворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначального объема. К мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% NаCl. Среду стерилизуют при 1А.

Солодовое (неохмельненное пивное) сусло – хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий. Основные компоненты сусла – углеводы (до 90% от общей массы сухого остатка) и азотсодержащие соединения (до 6-7% от общей массы сухого остатка). Из углеводов в наибольшем количестве содержится мальтоза и декстрины. В состав сусла входят витамины, преимущественно группы В, органические кислоты и минеральные соли.

Сусло готовят следующим образом. 250 г. размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48-500С и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие полчаса температуру поднимают до 55-580С и поддерживают на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т. е. до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит так же гидролиз белков до аминокислот и пептидов. Полученный экстракт фильтруют через бумажный диск. В фильтрате определяют концентрацию сахара, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в сусле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой. Для культивирования микроскопических грибов чаще всего используют 3-4 Б, для дрожжей 6-8 Б, для молочнокислых бактерий 8-12 Б сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 А 30 мин.

Дрожжевая среда – используется для культивирования ряда гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды – дрожжевая вода. Для ее приготовления необходимо 70-100 г свежих прессованных или 7-10 г сухих дожей 30 мин кипятят в 1 л воды и после осаждения клеток фильтрую через фильтр. К фильтрату добавляют 1 л воды еще раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. К 100 мл полученной дрожжевой воды добавляют 1-2 г углеводов и минеральные соли, чаще всего К2РО4 (0,1 г) и NaCl (10,5 г). Доводят рН среды до 6,8-7,2. Среду стерилизуют при 0,5 А 20-30 мин.

Картофельная среда – используется в основном для культивирования спорообразующих бактерий, представителей рода Caulobacter и некоторых других хемоорганотрофных бактерий. Для приготовления этой среды понадобится 200 г тщательно вымытого и очищенного от кожуры и глазков картофеля нарезают мелкими ломтиками, заливают 1 л воды и кипятят 20-30 мин. Отвар фильтруют через вату, доводят объем фильтрата до 1 л и разливают в сосуды для культивирования. Среду стерилизуют 1 ч при 1 А или 30 мин при 1,5 А.

Почвенный экстракт – используют главным образом для культивирования разнообразных представителей почвенной микрофлоры. Для его приготовления понадобится 500 г плодородной почвы, которую заливают 1,5 л воды и автоклавируют при 1 А 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр, добавляют к горячему фильтру 0,5 г СаСО3 тщательно перемешивают и через 5-7 мин фильтруют вновь. К экстракту еще добавляют 0,2 г К2НРО4 на каждые 1000 мл. Стерилизуют при 1 А.

Элективные питательные среды

Для культивирования стафилококков.

Молочно-солевой агар – к 100 мл МПБ добавляют 6,5 г NaCL, 20 г агара. Стерилизуют 1 А, добавить 10% стерильного обезжиренного молока (1,6%).

Желточно-солевой агар (агар Чистовича) – селективная среда, предназначенная для культивирования стафилококков. Содержит питательный агар, желток куриного яйца, повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые не препятствуют размножению стафилококков и обеспечивают элективность среды для данных микробов. Среда позволяет дифференцировать лецитиназопозитивные стафилококки, вокруг колоний, которых образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком.

К МПА добавляют 10% NaCL. Стерилизуют 1 А, добавить 20% желточной эмульсии и 1,5% агара.

Приготовление желточной взвеси – яйцо моют с мылом, протирают спиртом. Отделяют стерильным скальпелем желток и эмульгируют в 200 мл стерильного физиологического раствора. Не стерилизуют.