Методическая разработка по теме: «Питательные среды» (стр. 3 )

Кровяной агар – питательная среда для выявления гемолитических свойств бактерий. К расплавленному остуженному (до 45-500С) питательному агару асептически добавляют 5-10% дефибринированной крови, хорошо перемешивают и сразу же разливают в чашки Петри. Вокруг выросших колоний отчетливо видны прозрачные зоны гемолиза.

Для культивирования стрептококков.

К стерильному МПА в количестве 1 л добавляют 7% крови, 7,5 мг налидиксовой кислоты, 17 тыс ЕД полимиксина В, 2,12 немицина. Каждый антибиотик растворяют в 20 мл стерильной воды и добавляют раствор в питательную среду.

Для культивирования клостридий – анаэробов.

Среда Кита-Тароцци – обеспечивает рост многих спорообразующих и строгих аспорогенных анаэробов. Ее используют для культивирования и хранения клостридий. Состоит из питательного бульона, 2% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла. Выросшие анаэробы вызывают помутнение питательной среды.

100 г говяжьей печени нарезают и заливают 300 мл МПБ, кипятить 30 мин. Фильтрация. Печень промыть водой и поместить 3-4 кусочка печени в каждую пробирку добавить 8 мл МПБ. Стерилизуют и перед посевом кипятят, в конце заливают вазелиновым маслом.

Среда Вильсона-Блера

(ЖЕЛЕЗО-СУЛЬФИТНЫЙ АГАР) используется для выделения анаэробных бактерий. Готовится из питательного агара, к которому добавляют 1% глюкозы, хлорид железа и сульфит натрия. Анаэробные клостридии (Clostridium perfringens) образуют на среде колонии черного цвета за счет образования соединений железа с серой.

К 100 мл стерильного расплавленного и охлажденного до 80°С щелочного 3% МПА доливают 10 мл 20% свежеприготовленного стерильного (1 ч в текучем паре) раствора натрия сульфита и 1 мл 8% раствора железа хлорида, приготовленного на стерильной воде. Среду разливают в пробирки высоким столбиком и без стерилизации ставят в термостат при 37°С на сутки для проверки стерильности. Материал засевают уколом в столбик или в расплавленную и охлажденную среду. Патогенные и условно-патогенные анаэробы образуют в среде колонии черного цвета или дают сплошное почернение среды.

Для культивирования актиномицет.

Крахмальная среда – к 20 г крахмала добавить К2НРО4 0,5 г, KNO3 1 г, MgSO4 0,5 г, Na 0,5 г, FeSO4 0,01 г, Н2О 1 л.

Для культивирования псевдомонад.

Среда Кинга – к 20 г пептона добавить 10 г глицерина, К2 SO4 10 г, MgCL2 1,4 г, агар 20 г, Н2О 1 л.

Для культивирования энтеробактерий.

Среда ЭНДО - предназначена для выделения энтеробактерий, обнаружения эшерихий. Состоит из питательного агара, 1% лактозы и индикатора – основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском, лактозоотрицательные кишечные палочки образуют бесцветные колонии.

Контроль качества: колонии патогенных бактерий должны быть бесцветны, колонии E. coli – красные.

Качество среды можно проверить пробой Скородумова на альдегид.

На поверхность среды пинцетом помещают кружок фильтровальной бумаги с 2% раствором формалина. При хорошем качестве среды вокруг кружка, через 10 мин. появляется окрашенная зона в 2 мм. Имеющая металлический оттенок. Если кольцо не выражено, то среда пригодна к употреблению.

Среда Левина – среда предназначена для родовой идентификации энтеробактерий по способности утилизировать ацетат натрия; применяется для контроля пищевых продуктов при подозрении на присутствие в них шигелл.

Для культивирования сальмонелл.

Висмут - сульфит агар (ВСА) - селективная среда для выделения сальмонелл. Готовая среда непрозрачна, зеленоватого цвета. Содержит глюкозу, неорганические соли, бриллиантовый зеленый, питательный агар. Бриллиантовый зеленый и висмут подавляют рост грамположительной флоры и многих энтеробактерий, в том числе шигелл, эшерихий. Сальмонеллы при росте на среде выделяют сероводород, который взаимодействует с солями висмута. В результате образуются колонии черного цвета с металлическим оттенком на зеленоватом фоне среды.

Контроль качества: при наличии роста Salmonel из разведений 10-7-10-8 и при отсутствии роста E. coli из этих же разведений оценивается качество выросших колоний их размер и характер окраски.

Для культивирования азотофиксаторов.

Среда Эшби – к 20 г глюкозы добавляют К2НРО4 0,2 г, MgSO4 0,2 г, NaCL 0,2 г, К2SO4 0,2 г, СаСО3 5 г, 2% агара, Н2О 1 л. Для предупреждения роста грибов после стерилизации добавляют нистатин 1 таблетка на 200 мл среды.

Для культивирования грибов.

Среда Сабуро – к 4 г глюкозы добавляют 1 г пептона, 2 г агар, Н2О 100 мл.

Среда Чапика – к 30 г глюкозы добавляют 2 г NaNО3, 1 г КН2РO4, 0,5 г MgSO4, 0,5 г KCL, 0,01 г FeSO4, 4% агара, 100 мл Н2О.

Для культивирования молочнокислых бактерий.

Томатно-дрожжевая среда – к 40% томатного сока добавить 0,5%

дрожжевого экстракта, 0,05% крахмала, 1% пептона, 0,1% твин-80, 1% уксуснокислого Na, 0,5% глюкозы.

Приготовление соли А - К2НРО4 10 г, КН2РO4 10 г, 100 мл Н2О смешать компоненты и добавить в среду 0,5%.

Приготовление соли В - MgSO4*7Н2О 11,5 г, MnSO4*4Н2О 2,86 г, FeSO4*7Н2О 0,68 г 100 мл Н2О, отбирают из смеси 0,5% и добавляют в среду. Все смешивают с 3% агаром. Стерилизация 0,5 А.

Для культивирования микобактерий.

Среда Левенштейна—Йенсена - плотная питательная среда для выделения и культивирования микобактерий, содержащая глицерин, аспарагин, органические и неорганические соли, малахитовый зеленый, картофель и куриные яйца.

Размешать 37,24 г порошка в 600 мл дистиллированной воды, содержащей 12 мл глицерина (для некоторых видов микобактерий глицерин не добавлять). Прокипятить до полного растворения компонентов среды. Стерилизовать автоклавированием при 1А (1200С) в течение 15 мин. Приготовить стерильно 1000 мл эмульсии яиц. Асептически смешать 600 мл основы среды и 1000 мл яичной эмульсии до однородного состояния. Внести добавку Графта (Gruft Micobacterial Supplement FD053), если это необходимо. Разлить по пробиркам. Поместить пробирки в наклонном положении для формирования скошенной среды и прогревать (для коагуляции) при 8500С в течение 45 мин.

Принцип и оценка результата:

Оригинальная пропись Левенштейна была модифицирована Йенсеном, а Графт изменил среду добавлением двух антимикробных агентов. Среда, приготовленная на яичной основе, поддерживает рост различных видов микобактерий. Малахитовый зеленый, бензилпенициллин и налидиксовая кислота предотвращают рост большинства представителей сопутствующей флоры, в первую очередь той флоры, которая дает рост много раньше, чем микобактерии. РНК действует как стимулятор роста и позволяет повысить уровень высеваемости. Если могут быть выделены культуры бычьего или других глицерофобных видов микобактерий, глицерин добавлять не нужно. Малахитовый зеленый является не только ингибитором роста, но и pH-индикатором. Появление синих зон указывает на повышение кислотности за счет роста грамположительных контаминантов (например, Streptococcus spp.), желтые зоны выявляют контаминацию грамотрицательными бациллами. Протеолитические микроорганизмы формируют локальные зоны или полную деструкцию среды.

Среда Левенштейна–Йенсена в модификации Графта рекомендуется для выделения и культивирования штаммов Nocardia из мокроты, промывных вод желудка и другого клинического материала. Харди с соавт. рекомендуют инокулировать и инкубировать каждую пробу в трех экземплярах:

а) для обнаружения сапрофитов - при комнатной температуре (2500С);

б) для оценки пигментации фотохромогенных и скотохромогенных микобактерий — при 3500С (на свету и в темноте).

Наилучшие условия роста достигаются при 3500С в атмосфере 5–10 % углекислого газа.

Контроль качества: внешний вид порошка - гомогенный сыпучий порошок зеленовато-синего цвета. Цвет и прозрачность готовой среды - готовая среда имеет светлый голубовато-зеленый цвет с гладкой, слегка опалесцирующей поверхностью.

среда Пизу - питательная среда идентификации коринебактерий по типу расщепления цистина.

Предназначена для видовой индетификации коринебактерий при расщеплении цистина ферментов цистиназы образует в этот момент сероводород H2S вступает в реакцию с висмутом соединение темно-коричневого цвета.

Представляет собой мелкодисперсный порошок светло-желтого цвета, гигроскопичен, светочувствителен, готовят по этикетке, не стерилизуют, используют в течение 10 дней 2-80C.

Разливают в пробирки, производят посев уколом бактериальной петлёй температура 370С 18-20 часов. Почернение среды по уколу и образования облачка черного цвета в глубине указывают на наличие фермента цистиназы полученный результат.

Коринетоксагар - питательная среда для определения токсигенности дифтерийных микроорганизмов сухая. Сухой мелкодисперсный порошок светло-желтого цвета питательную среду в количестве указанном на этикетке раствор в 1литре H2O кипятить 3 мин, разливают во флаконы автоклавируют 1100С 30мин. После охлаждают добавляют 20% крови лошадиной, разводят в стерильной чашке Петри, среда прозрачная, желтая, хранится 14 суток t = 2-80C.

Размер фильтровальных полосок от 80*15 мм. Стерилизуют и помещают в стерильную чашку и смачивают дифтерийным анатоксином, который предварительно разведен в 1 мл дис. воды. Смоченные бумажки переносят пинцетом на поверхность питательной среды подсушивают в термостате t =370 20 мин. Рост токсигенных коринебактерий сопровождается образованием линий преципитации.

Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды

Агар Плоскирева - дифференциально-диагностическая и селективная, способствует лучшему росту некоторых бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов, дизентерий) и подавляет рост других (кишечная палочка и пр.). Содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Лактозонегативные колонии вырастают бесцветными, лактозопозитивные – красными. На некоторых модификациях среды Плоскирева выявляется еще и способность сальмонелл выделять сероводород: выросшие колонии чернеют.