Движения фрагментов миозина и компактные мембраносвязанные нити актина (стр. 2 )

Напротив, при высоких концентрациях ATP поступательное движение миофиламентов было едва заметно, и фрагментация нитей актина отсутствовала (дополнительный текст в ‘Материале и методах’, рисунок 5, Кино 5).

Вскоре после закрепления миофиламентов нити актина искажались и в конечном счете ломались, указывая на то, что сила, произведенная единичным миофиламентом, достаточна, чтобы сломать нить актина (Рисунок 3A, желтые стрелки, Кино 4). Впоследствии, сигнал флюоресценции нитей актина, ближайших к месту поломки, увеличился (Рисунок 3A, белые стрелки, рисунок 3C). Обнаруженное увеличение интенсивности флюоресценции нитей актина подразумевает, что фрагменты актина являются протаскиваемыми далее миофиламентами остающимися нитями актина во время их движения (рисунок 3A, D, Кино 4). Мы проанализировали наши данные TIRFM более подробно, отследив единичные миофиламенты во время их направленного движения вдоль нити актина (рисунок 3B, (Роджерс и др., 2007)) и определив скорость от траекторий (Рисунок 3C, красная кривая). Одновременно, интенсивность флюоресценции в зеленом (актин), канале области, занятой миофиламентом во время его движения, была измерена, обнаруживая события поломки, как тянувшийся фрагмент приводит к увеличению флюоресценции, ближайшей к месту поломки (Рисунок 3C, сине-черная кривая). Скорость колеблется во время движения миофиламента вдоль нити актина (Рисунок 3C, красная кривая), посредством чего события ускорения (Рисунок 3C, красные стрелки) близко сопровождаются увеличением флюоресценции актина, указывая, что событие поломки имело место (Рисунок 3C, черные стрелы, сине-черная кривая). Мы выдвигаем гипотезу, что фазы увеличивающейся напряженности между концами миофиламента приводят к деформации нити актина и совпадают с уменьшением в скорости, в то время как фазы выпуска напряженности немедленно после поломки нити актина могут привести к ускорению миофиламента (рисунок 3C, D).

(Таблица 1 должна быть здесь)

Чтобы объяснить деформацию и возможную поломку нити актина, мы предлагаем следующую модель: нить миозина выравнивает параллельные нити актина и взаимодействует с нею через головки миозина ((Продавцы и Качар, 1990), рисунок 3D). Один конец миофиламента, который мы будем именовать как ‘ведущий конец’, ориентирован к плюс-концу актина (колючий конец), как нити в мышце, и может поэтому идти по нити актина, гидролизируя ATP (рисунок 3D). Другой конец миофиламента, который мы будем именовать как ‘тянущийся конец’, отделенный от ведущего конца голой зоной приблизительно 160 нм длиной (Аль-Хаят и др., 2010) без головок миозина, ориентирован в противоположном направлении. В то время как тянущийся конец все еще взаимодействует с нитью актина, ее противоположными результатами ориентации в намного более медленном направленном движении к плюс-концу актина (Spudich и др., 1985; Продавцы и Качар, 1990). Каждая головка миозина независимо следует за биохимическим циклом, состоящим из гидролиза ATP, связанного с актином, рабочий ход, сопровождаемый разобщением фосфата, разобщением ADP, закреплением ATP, и наконец отделением от актина ((Говард, 2001), рисунок 8). Мы предполагаем, что головки на тянущемся конце все еще взаимодействуют с нитью актина и проходят тот же самый цикл, но другие не выполняют шаги, которые привели бы к поступательному движению (вероятность создания шага pst=0), или делают шаги с маленькой вероятностью (pst=0.1). Когда головка миозина делает шаг (размер шага d = 5 нм (Говард, 2001)) он пытается переместить целую нить миозина к плюс-концу актина, но другие приложенные головки миозина сдерживают его, таким образом производя трение (рисунок 3D). Тянущийся конец миофиламента функционирует, главным образом, как источник трения (эффективный 'тормоз'), но также двигается силой натяжения плюс-конца, проявленной к ведущему концу (рисунок 3D). Так как, главным образом, ведущий конец активно перемещается, и тянущемуся конец пассивно тянут (pst=0) или способствует слабо только его собственному движению (pst=0.1), напряженность растет в пределах миофиламента и передается на нить актина как сила сжатия. Если достаточно высоко, эта сила сжатия может вызвать деформацию, и наконец, поломку нити актина (рисунок 3D). После поломки ведущий конец может переместиться беспрепятственно дальше к плюс-концу, таща прерванную часть нити актина, приложенной к тянущемуся концу (рисунок 3D). Тянущийся конец может также быть свойственен снова актину, и дальнейшие события поломки на той же самой нити могут следовать.

Чтобы оценить необходимую силу для разрушения нити актина, мы моделируем нити как гибкие пруты со сгибающейся жесткостью EI = 60 nN мm2, определенные с постоянной длиной актина: LP = EI / (kT) = 15 мm (Yanagida и др., 1984). Сила, необходимая для сгиба и поломки нити F = р2 EI/l2. С длиной l миофиламента голая зона 160 нм, что дает силу 23 pN. Может напряженность в пределах миофиламента достигать до этой силы? Мы выполнили моделирования этой модели, описав приложенную головку миозина как пружину с постоянной упругостью, равной ригидности головки миозина к = 1 pN nm-1 (Kaya и Higuchi, 2010), и уравновесив все силы после каждого шага и каждого отделения головки миозина. От представления AFM миофиламента (рисунок 1C) и от известной структура миофиламента (Woodhead и др., 2005), мы оценили, что nm = 30 взаимодействующих головок миозина за нить. Результатом является чистое движение целого миофиламента к плюс-концу актина, с колеблющейся силой напряженности, скоростью и числом приложенных головок миозина, средние значения которых зависят от концентрации ATP (Рисунки 4A, B и 6). Мы отмечаем, что сила напряженности растет с уменьшением концентрации ATP, достигая сил, необходимых для поломки только в низкой (меньший, чем ∼3 мкм) концентрации ATP, в согласии с экспериментами (Рисунок 4A, видят также Таблицу 1). Когда нитям актина позволили согнуться в моделированиях в точке, где сгибающая сила 23 pN была достигнута (рисунок 4B), таким образом выпустив избыточную напряженность, кривизна нити постоянно увеличивается при низких концентрациях ATP, достигая критического искривления поломки 5.6 µm−1 ((Arai и др., 1999), рисунок 7A). При промежуточных концентрациях ATP искривление актина колебалось во времени, превышая порог искривления (Рисунки 4C и 7B). При более высоких концентрациях ATP пороговая сила была достигнута в слишком короткие периоды для нити, которая будет согнута к пункту поломки (Рисунки 4D и 7C). Результаты не зависят значительно от того, выполняют ли головки миозина на тянущемся конце шаги (pst=0.1) или нет (pst=0). Моделирования таким образом поддерживают идею, что в ряду концентрации ATP, используемом в экспериментах, различия во взаимодействиях перемещения и ведущих концах миофиламента с актином могут произвести силы сжатия на нити актина, и что эти силы достаточно высоки, чтобы согнуть и сломать нить актина.

Discussion

В нашей in vitro студии мы обеспечиваем потенциальный механизм, как оборот актина в клетках может быть установлен миофиламентом, который управляет фрагментацией актина. Чтобы согнуть и сломать нить актина, миофиламент должен быть присоединен к актину в течение достаточного количества времени, и достаточная сила должна быть произведена, требующая определенного среднего числа головок, привязанных к актину в любой момент времени. Учитывая небольшое количество взаимодействующих головок миозина, это переводит к требованию, чтобы большая часть головок была в связанном состоянии. В нашем испытании это было достигнуто с низкими концентрациями ATP. Заманчиво размышлять, что поломкой актина миофиламентами в естественных условиях управляет уровень ATP в клетке. Существуют недавние доказательства, что уровни ATP действительно изменяют значительно внутренние живые клетки (Imamura и др., 2009). Однако физиологические концентрации ATP, полученные из методов, которые обеспечивают усредненные уровни ATP без высокой пространственной и временной резолюции из извлечений клетки, обычно находятся в миллимолярном диапазоне (Beis и Newsholme, 1975). Здесь важно упомянуть, что миозин II скелетной мышцы (используемый в этом исследовании) имеет более низкий коэффициент заполнения и является поэтому менее поступательным, чем немышечный миозин в клетках (Харрис и Вошоу, 1993; Ван и др., 2003). Понижая концентрацию ATP в нашем испытании, мы увеличили коэффициент заполнения наших миофиламентов и таким образом сделали их более поступательными (дополнительный текст в ‘Материале и методах’, рисунок 5, Кино 5), подобно немышечному миозину, который соответствует предыдущим исследованиям (Хамфри и др., 2002; Смит и др., 2007; Соарес e Сильва и др., 2011). Кроме того, процессивность миофиламентов в клетках животных может также управляться фосфорилированием гирлянд миозина через другие белки, которые изменяют кинетические показатели биохимического цикла и таким образом увеличивают коэффициент заполнения миозинов, перемещающих наблюдаемое поведение в область высоких физиологических концентраций ATP (Загар и др., 1992; DeBiasio и др., 1996; Matsumura и др., 2001).

Наши моделирования показывают, что модель взаимодействия между актином и нитями миозина, описанная в тексте, правильно учитывает количественные значения параметров, известные из литературы (постоянные скорости). Самое главное она показывает, что достаточная сила, необходимая для сгибания и поломки нити актина, может быть произведена отдельным миофиламентом, приняв только различие во взаимодействии между продвижением и перемещением концов миофиламента (делающий шаг против не создания шага). Этот результат подразумевает, что присоединение ни актина, ни миозина к поддержке или любой другой жесткой конструкции не требуется для наблюдаемого процесса. Силы действуют в пределах отдельного миофиламента. Крепление нитей актина к мембране обеспечивает заключение нитей к плоскости, твердо не ограничивая нити поддержкой или лесами. Движение актина только ограничено эффективно более высокой вязкостью мембраны по сравнению с буферным раствором. Дальнейшее моделирование дает количественные данные модели, например, средние количества головок миозина в шести возможных состояниях (рисунок 9) и описывают колебания искривления нити актина (рисунок 4C, D). Другие параметры, которые могут быть получены из моделирований и могли быть по сравнению с новыми экспериментами, включают процессивность миозина как функции концентрации ATP и зависимость всеобщего поведения на длине миофиламентов.