Движения фрагментов миозина и компактные мембраносвязанные нити актина (стр. 4 )

Миозины были маркированы тиол - реактивными красками Алекс-Флуор-488 C5-малеимида, а также Алекс-Флуор-647 C2-малеимида (оба Молекулярных Исследования). Реакции маркировки были выполнены в небольшом изменении согласно протоколу изготовителя. Короче говоря, тиол-реактивные краски были разведены в диметилсульфоксиде к 10-миллиметровой концентрации и хранились при −80°C. Запас миозина (14.99 мкм в 50%-м глицерине) был растворен к 2 мкм в буфере реакции, содержащем 50-миллиметровый KCl, 10-миллиметровый буфер трижды-HCl (pH фактор 7.5) и 2-миллиметровый MgCl2. Раствор был деоксигирован в течение 15 минут под вакуумом и помещен в среду N2. 15-кратный молярный избыток (30 мкм) TCEP (тримараны (2- карбоксиэтил) фосфин, Молекулярные Исследования) был добавлен к раствору и выведен в течение 1 часа при комнатной температуре. 25-кратный молярный избыток для достижения 50 мкм красок малеимида был добавлен капля по капле к раствору, в то время как это размешивалось и выводилось быстро при 4°C. Маркированные миофиламенты были отделены от остающихся красок фильтрацией геля, чтобы получить 1 мкм (относится к отдельным миозинам), маркированных миофиламентов. Деятельность маркированных миозинов была подтверждена подвижностью и испытанием формирования рисунка актина. Определенные количества были заморожены и сохранены при −80 °C.

MAC (Minimal actin cortex) preparation

Для подготовки MAC-а камера, состоящая из укороченной 1.5 мл трубы Эппендорфа, приклеенная к стеклянной поверхности, очищенной воздушной плазмой (22 Ч 22 мм, № 1.5, Мензель Глэзер, Термо Фишер, Брауншвейг, Германия) был построен. Для плоских, поддерживаемых стеклом мольных отношений формирования двойного слоя липида липидов (?!) PC Egg (99.99, 99.9 и 99% молекулярной массы) и PEG (2000) - Биотин (0.01, 0.1 и 1% молекулярной массы) были растворены в хлороформе (полные 10 мг/мл липидов), высушены под потоком азота в течение 30 минут и впоследствии помещены в вакуум в течение 30 минут. Липиды тогда повторно гидратировались в буфере реакции, содержащем 50-миллиметровый KCl, 2-миллиметровый MgCl2, 1-миллиметровый DTT и 10-миллиметровый буфер трижды-HCl (pH фактор 7.5), и повторно приостанавливались энергичным вращением. Чтобы получить SUV-ов (небольшие однослойные пузырьки), суспензия была открыта для воздействия ультрахвуком в водяной бане при комнатной температуре. 10 мкл суспензии были смешаны с буфером реакции на 90 мкл и поместили на стеклянную поверхность камеры. CaCl2 к заключительной концентрации 0.1 мм был добавлен, чтобы вызвать сплав SUV-ов и формирование двойного слоя липида на стеклянной поверхности. Образец несколько раз промывался с суммарным объемом буфера реакции на приблизительно 2 мл, чтобы удалить несплавленные пузырьки. После мытья 2 мкг нейтравидина (Молекулярные Исследования) разведенные в буфере реакции на 200 мкл были добавлены к образцу и выведены при комнатной температуре в течение 10 минут. Образец несколько раз промывался с > 2 мл реакцией буфера для удаления несвязного нейтравидина. Тогда 10-50 мкл 2-ух мкм (относится к мономерам) Алекс-488-фаллоидина маркировали биотинилированные нити актина, были добавлены к двойному слою липида и выведены в течение 1 часа. Образец был тщательно промыт с буфером реакции на приблизительно 1-2 мл, чтобы удалить несвязные нити актина.

Actin fragmentation and pattern formation assay

Алекс-647 (и Алекс-488) маркировала миофиламенты и/или немаркировала миофиламенты различных концентраций (как обозначено) разведенные в буфере реакции на 200 мкл, были добавлены к MAC и отражены микроскопией TIRF. Буфер реакции содержал ATP на 0.1-1 мкм (см. также Таблицу 1), система регенерации ATP, состоящая из 20-миллиметрового фосфата Креатина (Сигма) и 0.1 мг ml−1. Креатин фосфо киназа (Сигма) нужен для сохранения концентрации ATP постоянной, а очищающая кислородная система (оксидаза глюкозы (165 U ml−1) каталаза (2,170 U ml−1), в-D-глюкоза (0.4% wt/vol) и тролокс (2 мм), все от Сигмы) - для уменьшения фотоотбеливания красок Алексы. Перестановки актина и фрагментация немедленно произошли после добавления миофиламентов.

TIRF microscopy

Двухцветная микроскопия TIRF была выполнена на изготовленной на заказ установке, построенной вокруг микроскопа Axiovert 200 (Zeiss), для рассмотрения деталей (Свободный и др., 2011). Масляная иммерсионный объектив Альфа Plan-Apochromat-а для 100Ч/NA 1.46 и лазерные линии на 647 нм и на 488 нм использовались для возбуждения маркированных исследований. Времена воздействия составляли или 50 мс, или 100 мс, и временные интервалы между каждой зарегистрированной структурой колебались с 200–400 мс для различных экспериментов.

AFM imaging

Атомная силовая микроскопия была выполнена, используя систему NanoWizard AFM (Инструменты JPK, Берлин, Германия). Головка AFM была установлена сверху стабильного чугунного предметного столика микроскопа и объединена с софокусным микроскопом LSM 510 (Карл Зейсс, Йена, Германия). Использовались мягкие, прямоугольные кремниевые кронштейны (CSC38/noAl, Микромесиво, Tallin, Эстония) с номинальной постоянной упругости 0.03 Н/м. Чувствительность кронштейнов в V/m была определена перед каждым измерением. Постоянная упругости была калибрована при помощи теплового метода колебаний. Чистые, круглые стеклянные поверхности (d = 24 мм, № 1.5, Мензель Глэзер, Термо Рыбак, Брауншвейг, Германия) были гидрофилизированы воздушной плазменной очисткой. Жидкая клетка AFM была собрана при помощи предметного стекла и заполнена 400 мкл буфера реакции. Непосредственно перед отображением AFM, миофиламенты были разбавлены буфером реакции к концентрации 10 нм. 5 мкл 10-ти нм миофиламентов в буфере реакции были добавлены к жидкой клетке. В экспериментах с объединенным AFM и отображении флюоресценции, использовались маркированные миофиламенты Алекс-488. После 15-минутной инкубаций большинство миофиламентов придерживалось гидрофильньной поверхности, остаточные нелипкие нити были удалены, промываясь с буфером реакции. Отображение AFM было выполнено в контактном режиме с частотой сканирования 1 Гц. Силы отображения были сохранены очень низкими (< 0.5 nN), непрерывно регулируя отклонение точки установки и используя оптимизированные коэффициенты обратной связи. Сырые изображения AFM были линейно и плоскостно приспособленны при помощи общедоступного программного обеспечения Gwyddion (www. ).

Myofilament length determination

Гистограммы длины миофиламентов были получены из софокусных изображений маркированных  Алекс-488 миофиламентов, подготовленных, как описано в секции отображения AFM. Софокусная микроскопия была выполнена, используя LSM 510 Meta System  (Карл Зейсс, Йену, Германия) с 40Ч водно-иммерсионным объективом (C-Apochromat, 40Ч/1.2, Карл Зейсс). Линия на 488 нм лазера Иона аргона использовалась, чтобы воздействовать на образец. Возбуждение флюоресценции и эмиссия были отделены, используя встроенное в микроскоп дихроическое зеркало (HFT 488/633) и фильтр полосы пропускания (BP 505–550) перед датчиком. Измерение длины миофиламента изображений AFM было вручную выполнено с помощью программного обеспечениея Gwyddion. Распределение длины миофиламента софокусных изображений с xy-размером-пикселя 110 нм было получено вручную, используя Изображение J. Точность определения длины, основанная на софокусной микроскопии, была проверена колокализацией с изображениями AFM. Идентичные длины нитей были получены, используя оба метода (r Пирсона = 0.99, n = 47) и поэтому оправдали большие измерения, используя софокусную микроскопию.

Data analysis

Анализ данных был выполнен c помощью Image J (Rasband, W. S., Национальные Институты Здоровья, США, http://imagej. nih. gov/ij) и сторонними написанными скриптами в IGOR Pro 6.0 (WaveMetrics, Лейк-Осуэго, США) и MatLab. Измерение длины нити актина (рисунок 2B) было выполнено, используя плагин NeuronJ J для Image J, для рассмотрения деталей (Meijering и др., 2004). Профили интенсивности флюоресценции для рисунка 2D, E (главный текст) были получены, используя сегментированный инструмент линии и профильную команду графика по Image J. Чтобы определить интенсивность флюоресценции в области, занятой маофиламентом (рисунок 3C [главный текст]) использовался сторонний написанный макрос для Image J. Короче говоря, последовательность изображения в канале на 647 нм Алекс-647 маркировала миофиламенты (красным), была преобразован в 8 битов, бинаризирована при помощи порогового фильтра, и был создан выбор области (соответствующиего миофиламента) для каждого бинарного изображения. Средняя интенсивность флюоресценции по соответствующим изображениям канала на 488 нм Алекс-488-фаллоидина маркированные нити актина (зелеными), была вычислена в отобранной области. Сглаживание профилей интенсивности на рисунке 3C проводилось, используя алгоритм сглаживания со скользящим средним (интервал 2 с), осуществленный в IGOR Pro.

Миофиламенты для скоростного анализа были прослежены, используя сторонню программу, написанную Роджерсом и др. (для получения дополнительной информации посмотрите (Роджерс и др., 2007)). Радиальная скорость vt была вычислена из траекторий миофиламента xt, yt, где t является дискретным временем выборки с интервалом Дt = 0.2 с. Радиальное изменение в положении было вычислено Дrt = ((xt+nДt − xt)2 + (yt+nДt − yt)2)1/2. Окружная скорость была получена из vt = Дrt/nДt. Интервалы вычисления nДt с n = 20 были выбраны, чтобы уменьшить шум, вызванный маленькими колебаниями в положениях.