Движения фрагментов миозина и компактные мембраносвязанные нити актина (стр. 3 )

В заключение, наши результаты показывают различные функции, которые движения миозина могут выполнять. В нашей минимальной системе, фрагмент миофиламента и компактный мембраносвязанный актин. Мы непосредственно показываем, что отдельные миофиламенты могут взаимодействовать с актином таким образом, при котором может быть произведена достаточная сила, чтобы сломать нить, без миофиламента или без актина, присоединенного основательно к твердой поддержке или лесам. Мы предполагаем, что фрагментация и уплотнение миофиламентов вносят в наблюдаемое крупномасштабное формирование рисунка сетей актомиозина также в другие in vitro системы (Backouche и др., 2006; Смит и др., 2007; Соарес e Сильва и др., 2011; Гордон и др., 2012). В естественных условиях поломка связок актина, как было показано, произошла в нейронных конусах роста в миозине II зависимым образом и, как полагаем, важна для переработки актина (Medeiros и др., 2006). Мы предполагаем, что наблюдаемая фрагментация и уплотнение мембраносвязанных нитей актина миозинами в нашей in vitro системе могли служить возможным общим механизмом для оборота актина и модернизации кортикального слоя клетки актина.

Material and methods

Details of the experiments

Традиционно, отдельные движения мышечного миозина II описаны как непоступательные движения (Говард, 2001). Собирая движения миозина в нити, миофиламенты становятся поступательными из-за сцепления более высокого числа головок миозина, которые находятся в контакте с нитью актина. В направленном движении нашей минимальной системы, сопровождаемом только фрагментацией нити актина, происходящей только при низких концентрациях ATP между 0.1-1 мкм (рисунок 3, Таблица 1, Кино 3). Более низкие концентрации ATP, как ожидают, увеличат продолжительность направляющегося актином состояния пострабочего хода головки миозина, таким образом увеличивая коэффициента заполнения и процессивности (Говард, 2001). Чрезвычайно низкие концентрации ATP, с другой стороны, не достаточны для моторной деятельности миозина. Чтобы проверить эффект концентрации ATP на процессивность, мы добавили Алекса-647, маркирующую миофиламенты к средней плотности MAC-ов и отслеживающую (Роджерс и др. 2007) движение отдельных миофиламент в низком (1 мкм) и высокой (4-миллиметровых) концентрациях ATP (рисунок 5, Кино 5). (Обратите внимание на то, что фрагментация и уплотнение нитей актина произошли только при низких концентрациях ATP). Сравнение траекторий показывает, что низкие траектории ATP в среднем более длинны, чем высокие траектории ATP, указывающие на более высокую процессивность при низких условиях ATP (рисунок 5, Кино 5). Кроме того, число отслеженных миофиламентов при низкой концентрации ATP со временем выдержки больше, чем 900 мс, было больше чем в шесть раз выше, чем при высокой концентрации ATP, предлагающей более высокий коэффициент заполнения на низких уровнях ATP (n = 681 в низкой ATP, n = 102 в высокой ATP; рисунок 5, Кино 5). Высокие концентрации ATP поэтому приводят к более быстрому отделению миофиламентов от нитей актина, чем при низких концентрациях ATP (Кино 5). Мы предполагаем, что увеличение процессивности из-за лишения ATP было необходимо для поступательного движения и предпосылки для фрагментации и уплотнения нитей актина.

Details of the model

Biochemical cycle

В модели взаимодействия миофиламент с актином мы предполагаем, что каждая активная головка миозина проходит следующий биохимический цикл, состоящий из шести главных состояний (Говард, 2001). Шесть состояний схематизированы на рисунке 8. Развязанная головка миозина с ATP (сост. 1) гидролизирует ATP с уровнем k1 = 100 s-1(сост. 2), связывается с нитью актина с уровнем k2 = 30 s-1 (сост.  3), быстро выпускает фосфат, осуществляя рабочий ход с уровнем k3 = 104 s-1 (сост.  4), выпускает ADP с уровнем k4 = 1000 s-1 (сост.  5), связывает ATP с уровнем k5 = kt [ATP], где kt = 4 мM−1 s-1, (сост.  6), и отделяют от нити актина с уровнем k6 = 2000 s-1 (сост.  1). Эти показатели определяют среднее время, которое головки миозина проводят в каждом состоянии (рисунок 9). В этой простой модели показатели, как предполагается, независимы от растяжения головки миозина. Размер шага миозина d = 5 нм (Говард, 2001). Головки миозина продвижения конца миофиламента всегда выполняют шаг в результате рабочего хода между состояниями 3 и 4. Головки тянущегося конца каждая не делает шаг (вероятность создания шага pst=0), или, в отдельных моделированиях, делают шаг с вероятностью pst=0.1. Это значение основано на наблюдениях, которые тянущийся конец миофиламента проходит вдоль актина с приблизительно в десять раз более медленной скоростью, чем ведущий конец (Продавцы и Качар, 1990).

Mechanical equillibrium

Каждая головка миозина была свойственна нити актина, описана как пружина с постоянной упругостью, равной ригидности головки миозина к = 1 pN nm-1 (Kaya и Higuchi, 2010). После каждого шага и после каждого отделения головки миозина, силы уравновешиваются движением миофиламента вдоль нити актина. Результатом является чистое движение целого миофиламента к плюс-концу актина, с колеблющейся силой напряженности, скоростью и числом приложенных головок миозина, средние значения которых зависят от концентрации ATP.

Number of myosin heads on the myofilament

Средняя длина миофиламента, определенного с AFM, составляла 560 нм (рисунок 1C). Предполагая, что длина голой зоны без головок миозина в центральной части миофиламента 160 нм (Аль-Хаят и др., 2010), оба конца миофиламента 200 нм длиной. С четырьмя парами головок миозина вокруг длина окружности миофиламента через каждые 14.5 нм (Woodhead и др., 2005), на каждом миофиламенте есть в среднем 110 главных пар. Предположим далее, что только те головки, ориентированные к одной стороне, то есть, одной четверти, могут взаимодействовать с нитью актина, и что только одна головка главной пары благоприятно ориентирована, чтобы взаимодействовать, мы оцениваем среднее число взаимодействующих головок как 30 на миофиламент.

Buckling force

Чтобы оценить силу, необходимую для сгибания нити актина, мы моделируем его как гибкий прут со сгибающейся жесткостью EI = 60 nN мm2, определенный с постоянной длиной актина: LP = EI / (kT) = 15 мm (Yanagida и др., 1984). Сила, необходимая для сгибания и поломки нити  F = р2 EI/l2. С длиной l голая зона миофиламента 160 нм, это дает силу 23 pN. Нити актина ломаются, когда радиус кривизны нити склонности опускается ниже 0.18 мm (Arai и др., 1999), соответствую искривлению 1/r = 5.6 мm-1.

Results of the simulations

Чтобы узнать, может ли напряженность в пределах миофиламента, переданного на нить актина как сила сжатия, стать достаточно высокой, чтобы согнуть и сломать нить актина, мы выполнили два типа моделирований.

В первом случае изгиб нити не был позволен, и никакой предел не был наложен на силу сжатия в пределах нити актина. Это позволило нам определять силы, которые могут быть достигнуты этой моделью. Во втором случае нити актина позволили согнуться, когда сила 23 pN была превышена. Изгиб актина был смоделирован, уменьшая расстояние между продвижением и перемещением концов миофиламента, таким образом ослабление напряжения и сокращение силы вниз к 23 pN.

В случае, когда изгиб не был позволен, средняя сила увеличилась с уменьшением концентрации ATP, и также с растущим числом головок миозина (рисунок 4A). Для 30 головок миозина сила 23 pN, необходимая для сгибания нити, могла быть достигнута при концентрациях ATP приблизительно 3 мкм или ниже (рисунке 4A).

В ряду концентрации ATP, используемом в экспериментах здесь (<100 µM, см. также Таблицу 1), средняя скорость миофиламента увеличилась приблизительно линейно с концентрацией ATP, независимо от числа голов миозина, или факта, был ли изгиб актина позволен или не (рисунок 6A). Средняя часть голов миозина была свойственна актину, увеличенному с уменьшением концентрации ATP (рисунок 6B), и так как выступление глав миозина друг независимо от друга и вовлеченных сил, было также независимо от числа голов миозина и изгиба актина.

Когда нити актина позволили согнуться, максимальной силе не разрешили превысить 23 pN (рисунок 4B). При низкой концентрации ATP произведенная сила была достаточно высока, чтобы непрерывно сгибать нить актина, постоянно увеличивая искривление выше порога поломки (рисунок 7A). При промежуточных концентрациях ATP сила, колеблющаяся около порога, вызвала колебания в искривлении во времени, превысив порог искривления и затем ослабившись снова к прямой конфигурации нити (Рисунки 4C и 7B). При еще более высоких концентрациях ATP пороговая сила была достигнута слишком короткие периоды для достаточно высокого искривления, чтобы развить (Рисунки 4D и 7C).

Результаты для сценария, где головки миозина тянущегося конца могут сделать шаг к плюс-концу актина с вероятностью pst=0.1, очень подобны тем с pst=0. Различия в том, что произведенные силы немного ниже (рисунок 4A, B) и средняя скорость немного выше (рисунок 6A).

Actin preparation and labeling

Мономеры актина скелетной мышцы кролика (Молекулярные Исследования) и биотинилированные мономеры актина кролика (tebu-bio [Cytoskeleton Inc.]) были смешаны в отношении 5:1 (actin:biotin-aktin). Полимеризация смеси (39.6 мкм) была вызвана в F-буфере, содержащем 50-миллиметровый KCl, 2-миллиметровый MgCl2, 1-миллиметровый DTT, 1-миллиметровую ATP, 10-миллиметровый буфер Тris-HCl (pH фактор 7.5). Биотинилированные нити актина были маркированы Alex-флюоритом-488 Фаллоидин ом (Молекулярные Исследования) согласно протоколу изготовителя. Наконец, 2 мкм (относится к мономерам) маркированных биотинилированных нитей актина Алекс-488-Фаллоидин были получены.

Myosin preparation and labeling

Миозин был очищен от ткани скелетной мышцы кролика, как ранее описано (Смит и др., 2007). Активность миозина была проверена классическим испытанием подвижности, где миозины, связанные с покрытой нитроцеллюлозой стеклянной поверхностью опрыскивающей камеры (tebu-bio [Cytoskeleton Inc.]), продвигают нити актина. Движение нитей актина указало на целостность движений миозина (данные, не показанные). Собрание миофиламентов было вызвано в буфере реакции, содержащем 50-миллиметровый KCl, 2-миллиметровый MgCl2, 1-миллиметровый DTT и 10-миллиметровый буфер трижды-HCl (pH фактор 7.5), и в зависимости от экспериментов различные суммы восстановленной ATP и кислородной очищающей системы. Уравновешивание смеси в течение приблизительно 30 минут дало нам среднюю длину 560 нм в нашей системе (рисунок 1C).