Движения фрагментов миозина и компактные мембраносвязанные нити актина (стр. 1 )

кортикальный слой – кора

in vitro – искусственно, в пробирке

meshwork – сетчатая структура, полносвязная сеть

ATP = АТФ – Аденозинтрифосфат

ADP = АДФ - Аденозиндифосфат

Движения фрагментов миозина и компактные мембраносвязанные нити актина

Abstract

Коррекция кортикального слоя клетки во время клеточного деления является результатом миофиламент-управляемой сокращаемости корковой мембраносвязанной сетки актина. Мало известно о взаимодействии между отдельным миофиламентами и мембраносвязанными нитями актина. Здесь мы воссоздавали минимальную кору актина, чтобы непосредственно визуализировать действие отдельных миофиламентов на мембраносвязанне нити актина, используя микроскопию TIRF. Мы показываем, что синтетические фрагменты миофиламента и компактный мембраносвязанный актин поступательно проходят нити актина. Мы предлагаем механизм, посредством которого напряжение накапливается между концами миофиламентов, в результате чего сила сжатия, действующая на отдельные нити актина, вызывает их деформацию и поломку. Моделирование этого механизма показало, что достаточная сила (∼20 pN) может быть произведена путем отдельных миофиламетов, чтобы согнуть и сломать нити актина. Этот механизм фрагментации нити и уплотнения может способствовать обороту актина и перестройке коры во время цитокинеза.

Introduction

Кортикальный слой актина состоит из тонкой актиновой сетки, связанной с внутренней цитозольной стороной плазменной мембраны различными якорными белками (Мороне и др., 2006). Это играет основную роль в обеспечении механической стабильности в клеточной мембране, и в управлении изменениями формы клетки во время передвижения клетки и клеточного деления (Вессельс и др., 1971; Брей и Вайт, 1988; Диз-Муньоз и др., 2010; Седзинский и др., 2011). Многие из этих особенностей полагаются на надлежащее функционирование моторного миозина актина II (Де Лозанн и Спудич, 1987; Крамер и Мичисон, 1995). Миозин II в коре актина функционирует как узлы моторных белков, формирующих анти-параллельные расположенные биполярные нити (миофиламенты) с моторными областями и на концах нити ((Verkhovsky и Borisy, 1993; Verkhovsky и др., 1995), рисунок 1A). Помимо того, чтобы быть генератором силы, необходимым для модернизации коры клетки и кольцевого сжатия актомиозина во время цитокинеза, есть доказательства, что миофиламенты также способствуют обороту нити актина во время цитокинеза (Бюргер, 2005; Guha и др., 2005; Мерти и Уодсуорт, 2005). Во всех этих процессах не понятен микроскопический механизм взаимодействия между отдельными миофиламентами и мембраносвязанными нитями актина. Из-за обширной сложности клеточных систем, много усилий было потрачено, чтобы исследовать последствия актин-миозин взаимодействий с точки зрения iv vitro («в пробирке», искусственно; наверное, имеется в виду искусственное воспроизведение этих процессов). (Backouche и др., 2006; Смит и др., 2007; Schaller и др., 2010; Колер и др., 2011; Соарес e Сильва и др., 2011; Гордон и др., 2012; Рейман и др., 2012). Однако эти исследования сосредоточились на вызванном миозином формировании структуры актина в мезоскопическом масштабе, а не во взаимодействии между актином и отдельным миофиламентами. Кроме того, мембраносвязанные минимальные системы актина только недавно начали функционально воссоздаваться (Фогель и Швилл, 2012). Чтобы заполнить промежуток в понимании отдельных взаимодействий миофиламента-актина, мы непосредственно визуализировали действие миофиламентов на мембраносвязанных нитях актина в минимальной in vitro системе и дополнили экспериментальные результаты теоретической моделью.

eLife digest

Актин является многофункциональным белком, который найден в почти всех эукариотических клетках. Когда полимеризируется, он формирует прочные нити, которые участвуют во множестве клеточных процессов. Например, нити актина вовлечены в сокращение мышц, и они - также главный компонент в различных структурах, которые поддерживают и управляют формой клеток, когда они двигаются и делятся. Эти структуры включают кортикальный слой клетки, связную сеть нитей актина, которая связана с внутренней поверхностью плазменной мембраны якорными белками. Однако и кортикальный слой клетки, и плазменная мембрана должны претерпеть серьезные изменения, когда клетка делится, и силы, которые ведут эти изменения, произведены другим белком, миозином II.

Миозин II содержит три области: главная область, также известная как моторная область, которая связывает с актином; область шеи; и область хвоста. Как актин, миозин II белков также формирует нити, но у этих миофиламентов есть отличительная структура: хвостовые области двух Миозин II белков объединяются с моторными областями, находящимися в обоих концах нити. Когда активирована, моторные области захватывают нити актина и тянут против них в «рабочий ход». Однако детали взаимодействий между моторными областями миофиламентов и нитями актина в кортикальном слое клетки, которые связаны с плазменной мембраной, не полностью поняты.

Изучение этих процессов в живых клетках чрезвычайно сложно, таким образом, Фогель и др. построил iv vitro модель кортикального слоя клетки, и затем использовал отображение отдельной молекулы, чтобы наблюдать взаимодействия между миофиламентами и нитями актина в этой модели. Они показывают, что миофиламенты проходят актин в коре, разбивая нити и сжимая их в процессе. Они предлагают, чтобы напряженность росла между концами миофиламенов, приводя к сжимающему усилию, проявляемому на нитях актина. Компьютерные моделирования подтверждают, что произведенные силы достаточно высоки, чтобы заставить нити актина сгибаться и ломаться. In vitro модель, развитая Фогелем и др., должна позволить исследователям разъяснять основные биофизические принципы, которые подкрепляют структуру и функцию кортикального слоя клетки.

Results

Чтобы имитировать кортикальный слой клетки, мы развивали ‘минимальную кору актина’ (MAC), состоящую из нитей актина, соединенных с поддержанным двойным слоем липида через биотин нейтравидин связи (рисунок 1A). Мы использовали Алекс-488-фаллоидин, стабилизированную, а также неустойчивую (данные не показаны) нити актина для состава MAC. Изменяя количество биотинилированных липидов, существующих в двойном слое липида, мы управляем плотностью слоя актина (рисунок 1B). Чтобы понять, что происхождение сокращаемости наблюдало в коре клетки, мы проверили ответ MAC после добавления движений миозина. Миозин II мышцы кролика был очищен и повторно собирал формирующийся биполярный синтетический продукт миофиламентов с типичной длиной 500-600 нм (рисунок 1C). Отображение промежутка времени MAC-ов с различными удельными весами актина, используя микроскопию флюоресценции полного внутреннего отражения (TIRFM), показало динамическую перестановку нитей актина, и впоследствии формирование очагов актомиозина ATP-зависимым способом немедленно после добавления миофиламентов (рисунок 1D, ролик 1). Формирование рисунка актина произошло при концентрациях ATP между 0.1-1 мкм в системах, где ATP ферментативным образом восстановлена (Таблица 1) в 94% экспериментов (n = 45 экспериментов). При более низкой концентрации ATP, формирование рисунка актина в MAC отсутствует. О формировании структуры актина после истощения ATP также сообщили для экспериментов, используя актин и миофиламенты в решении (Смит и др., 2007). При низких концентрациях ATP миофиламенты были предсказаны, чтобы функционировать как активный временный соединитель, который может вести самособрание нитей актина в группы актина.

Чтобы понять детали взаимодействий миофиламента-актина при низких концентрациях ATP во время формирования рисунка актина, мы добавили миофиламенты к MAC-ам низкой плотности. Если бы соединение актина миофиламентами было единственной предпосылкой для формирования рисунка, то мы не ожидали бы (быстрого) формирования рисунка в MAC-ах низкой плотности, из-за больших расстояний между нитями актина относительно длины миофиламентов. Поразительно, добавление миофиламентов к MAC-ам низкой плотности показало события поломки и уплотнения нитей актина, приводящих к их сокращению в течение долгого времени во всех экспериментах (n = 21, рисунок 2A-C, ролик 2). После 20 минут большинство нитей актина было сокращено к, в среднем, половине их длины образца до испытания, и большинство фрагментов соединялось в отдельные очаги (рисунок 2A, B, Кино 2). Обратите внимание на то, что нити актина оставались неповрежденными, когда представлены в отсутствие миофиламентов (данные, не показанные). После добавления миофиламента нити актина часто показывали деформации до поломки нити актина (Рисунок 2C, желтые стрелки, ролик 3), указывая, что сила проявлена миофиламентами, и напряжение вдоль нити актина может выстроиться вплоть до разрывов нити актина. Точно так же недавние доказательства подразумевали, что воздействие связок актин/фаскин с миофиламентами может вызвать их разборку и разъединение неизвестным процессом (Backouche и др., 2006; Haviv и др., 2008; Торесен и др., 2011).

Кроме того, увеличение интенсивности флюоресценции вдоль остающейся нити актина часто наблюдается после события фрагментации (Рисунок 2C, белые стрелки, рисунок 2D, E). Интенсивность флюоресценции, ближайшая к месту поломки, приблизительно вдвое более высока по сравнению с остальной частью нити актина, предполагая, что фрагмент тянется вдоль остающейся нити актина, приводящий миофиламенты к их уплотнению (рисунок 2C-E, Кино 3). Мы предполагаем, что фрагментация и уплотнение способствовали наблюдаемому соединению фрагментов актина в отдельные очаги во время динамической перестановки нитей актина (Рисунки 1D и 2A, Ролики 1 и 2).

Чтобы определить, как миофиламенты выполняют фрагментацию и уплотнение и проверить, требуют ли эти процессы (организованные) действия множества миофиламентов, мы уменьшали концентрацию миофиламентов до уровня отдельной молекулы. Алекс-647 маркировала миофиламенты, добавленные к MACам с низкой плотностью актина и отмеченные двухцветным TIRFM. После закрепления единичных миофиламентов к отдельным нитям актина мы наблюдали направленное движение миофиламентов вдоль нитей актина и фрагментации актина при низких концентрациях ATP (рисунок 3A, Кино 4, Таблица 1, рисунок 5). 68% индивидуально наблюдаемых миофиламентов показали направленное движение и 50% продемонстрировали фрагментацию и уплотнение нити актина (общее количество миофиламентов = 152; 7 экспериментов). В случаях, где и фрагментация, и уплотнение произошли, 95% наблюдаемых миофиламентов показали направленное движение вдоль нитей актина, в то время как 5% оставались постоянными в своем исходном связывающем участке (общее количество фрагментирования миофиламентов = 75; семь экспериментов).