Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно
действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http:///readings/
Поступила в редакцию 15 ноября 2016 г. УДК 340.67:615:21:7.099.074:543.544.
Определение нафазолина (назальные капли нафтизин)
и циклопентолата (глазные капели цикломед)
в биологических жидкостях
© Киреева1 Анна Владимировна, Анисимова2 Наталия Аскольдовна
и Куклин2*+ Владимир Николаевич
1 КУЗ Ленинградской области Бюро судебно-медицинской экспертизы. г. Санкт-Петербург. Россия.
2 Кафедра фармацевтической химии. Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия.
Ул. Проф. Попова, Лит. А. г. Санкт-Петербург, 197376. Россия.
Тел.: (812) 234-13-59. E-mail: *****@***ru
_______________________________________________
*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку
Ключевые слова: нафазолин, циклопенилат идентификация, количественное определение.
Аннотация
Определены оптимальные условия изолирования нафазолина и циклопенталата из биологи-ческих жидкостей нафазолин – хлороформом при рН 9.18 среды, циклопентилат – хлороформом – 2-пропанол (9:1) при рН 10 среды. Выделенные вещества и их метаболиты из биологических жид-костей идентифицировали с применением цветных и осадочных реакций, методами ИК, УФ спектро-скопии, тонкослойной, газовой хроматографией с масс-селективным детектором и высокоэффек-тивной хроматографией. Количественное определение в извлечениях из биологических жидкостей осуществляли методами ВЭЖХ хромато-денситометрией, УФ спектроскопией и хромато – массспект-рометрией. Результаты разных, методов сопоставимы.
В виду того, что перед журналом стоит задача вхождения в базу данных Scopus и Web of Science, то мы должны приводить структуру статей в соответствие с их требованиями. Одним из таких требований является наличие 250 слов в тексте аннотации. В этой связи просим Вас переписать аннотацию и перевести исправленный вариант на английский язык.
Количество слов в аннотации можно узнать в MS Word 2003 выделив текст, войти в информационной панели в Сервис и затем в Статистику. В MS Word 2007, выделяют весь текст аннотации и на нижней информационной панели нажимают на секцию “Число слов”, в возникшем статистическом окошке смотрят численное значение.
Введение
В последнее годы по данным бюро судебно-медицинской экспертизы и наркологических дис-пансеров в разных регионов России, отмечены случаи не медицинского применения назального препарата Нафтизин и глазных капель: Цикломед и Тропикамид (последний наконец-то поставили на количественный учет) в сочетании с наркотическими и психотропными средствами. Перечисленные препараты широко используют наркозависимые люди как фармакологическую добавку к героину, в виду того, что они способны изменять картину опьянения и удлинять его продолжительность. Это в свою очередь приводит к увеличению количества отравлений, в том числе со смертельным исходом. В настоящее время наблюдается рост отравлений нафтизином и его гомологами (санорин, глазолин) у детей, что связано с приемом его без назначения врача, возможной передозировкой без учета возраста ребенка и небрежным хранением препарата в домашних условиях [1- 3].
Методики химико-токсикологического анализа в биологических жидкостях при отравлениях циклопентолатом, нафазолином отсутствуют, что не позволяет сделать заключение об использовании препаратов Нафтизин и Цикломед в немедицинских целях.
Цель исследования – разработка методик определения нафазолина и циклопентолата в биологи-ческих жидкостях (моча, кровь) при судебно – химической и химико – токсикологической экспертизе.
Экспериментальная часть
Материалы и методы. Препарат «Цикломед» – раствор 1%, который должен отпускаться по рецепту врача, но не подлежит предметно количественному учету, что усложняет проверку соблюде-ния аптеками порядка его отпуска. Действующее средство циклопентолата гидрохлорид. Химическое название: 2-диметиламиноэтил-2-(1-гидроксициклопентил)-2-фенилацетата гидрохлорид. Хорошо вса-сывается через конъюнктиву, определяемая концентрация в ЦНС достигается через 0.5-1 ч. На 40-60% связывается с белками плазмы крови, Т1/2 – 2 ч [3]. Препарат Нафтизин – раствор 0.1% по фарма-кологическому действию относится к адреномиметикам преимущественно влияющим на б-адре-норецепторы. Действующее средство нафазолина нитрат. Химическое название 2-(1-нафтилметил)- имидозолина нитрат. Данные о фармакокинетике и фармакодинамике препарата в доступной для нас литературе найти не удалось. Кодеин, морфин выделены из токси – дисков системы TOXI – LAB. Биологические жидкости (кровь, моча) добровольцев и экспериментальных животных (крысы).
При проведении исследования в качестве рабочего стандартного образца (РСО) использовали циклопентолат и нафазолин основания, выделенные из лекарственных форм – капли цикломеда, раствор 1% и капли нафтизина, раствор 0.1% [4], подлинность и чистота, которых были подтверждены химическими и физико-химическими методами анализа.
Разработка методик химико-токсикологического анализа циклопентолата и нафазолина в биоло-гических жидкостях осуществлялась с применением следующей аппаратуры: Ультрафиолетовый спектро-фотометр марки СФ 2000; Жидкостной хроматограф Agilent 1200 с диодно-матричным детектором; Газовый хроматограф Agilent HP 6850 с масс-селективным детектором НР 5973N оборудование фирмы Hewlett Packard (США); Пластинки Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ с полимерной подложкой.
Для проведения цветных и осадочных реакций и физико-химических исследований использо-вались следующие реактивы и растворители: реактив Драгендорфа, реактив Марки, реактив Манде-лина, реактив Бушарда-Вагнера, серная кислота концентрированная, азотная кислота концентрирован-ная, хлористоводородной кислоты раствор 0.1 М, аммиак водный, натрия сульфат безводный. Раство-рители марки «ХЧ» и «ЧДА»: хлороформ, этанол, ацетон, 2-пропанол, этилацетат, гексан и ацето-нитрил.
Известно, что для вещественных доказательствах и биологических жидкостей при судебно-хими-ческой экспертизе лекарственных средств, с достаточной степенью вероятности следует применять цветные и осадочные реакции, тонкослойную хроматографию (ТСХ) на предварительном этапе исследования и на подтверждающем высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), хро-матомасс-спектрометрию (ГХ/МС), ультрафиолетовую (УФ) и инфракрасную (ИК) спектроскопию [5-7].
Результаты и их обсуждение
Для определения процента извлечения оснований циклопетолата и нафозолина из биоло-гических жидкостей готовили модельные смеси. Использовались образцы мочи и крови от здоровых добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение 1 мес до отбора биологических жидкостей. Модельные смеси мочи и крови готовили путем добавления рабо-чего стандартного раствора с концентрацией 10 мг/мл к биожидкостям, до получения кон-центраций 0.5; 1.0; 2.0 мг/мл. Приготовленные модельные смеси инкубировали при темпера-туре 37 oС 2 ч. Изолирование циклопентолата основание проподили смесью хлороформ-2-пропанол (9:1) при рН 10 среды из крови после осаждения белков 10% раствором вольфра-мата натрия и серной кислоты раствора 10%; из мочи прямая жидкость жидкостная экстрак-ция (без кислотного гидролиза). Для нафазолина основания экстракцию проводили из раст-вора боратного буфера (рН среды 9.18) хлороформом. Для крови после осаждения белков, для мочи кислотный гидролиз в присутствии хлористоводородной кислоты концентрированной. Процент извлечения циклопентолата и нафазолина оснований из биологических жидкостей определялся методом УФ спектрофотометрии (табл. 1).
Табл. 1. Процент извлечения циклопентолата и нафазолина оснований из модельных комплексов
|
Разработанные методики химии-ко-токсикологического анализа цикло-пентолата и нафозолина оснований в биологических жидкостях были апро-бированы на экспериментальных жи-вотных, поскольку они при определён-ной степени воспроизводят процессы, происходящие с ксенобиотиками, при введении последних, в живой орга-низм.
Нами было проведено исследо-вание для каждого препарата на 15 экспериментальных животных – белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Растворы препаратов «Цикломед» и «Нафтизин» вводили однократно внутрибрюшинно в количестве 1-2 мг действующего вещества, с последующим введением водной нагрузки. Сравнение прово-дили с контрольной группой из 5 животных, которым внутрибрюшинно вводилась вода для инъекций. Забор крови производили из десны через 1.2 и 4 часа. Забор мочи производился в течение 24 ч. На анализ было взято по 3 мл крови и 4-5 мл мочи от каждого животного.
Изолирование циклопентолата и нафазолина осгований из биологических жидкостей животных проводили по разработанной нами методике.
Для изолирования циклопенталата нафазолина оснований из биологических жидкостей экспериментальных животных был использован, так же метод твердофазной экстракции (ТФЭ) [8], который основан на использовании патронов с разными сорбционными свойст-вами, что позволяет избирательно адсорбировать на поверхности сорбента патрона вещества разной химической природы. Основные преимущества этого метода по сравнению, с традиционными – возможность одновременного выделения и концентрирования исследуе-мого вещества, а также значительное увеличение скорости и эффективности экстракции. Удалось увеличить процент экстракции циклопенталата нафазолина оснований методом ТФЭ из биологических жидкостей по сравнению с жидкость-жидкостной экстракцией в полтора – два раза. К сожалению, нам не удалось подобрать условия для экстракции циклопентолата и нафазолина оснований из мочи методом ТФЭ. Этот вопрос открыт для дальнейшего иссле-дования.
Анализ извлечений из биологических жидкостей после очистки проводили методами ТСХ, УФ, ВЭЖХ и ГХ/МС.
В извлечении из крови через 1 и 2 часа циклопентолат и нафазолин основания были обнаружены через 4 ч препараты с использованием доступных нам физико-химических мето-дов обнаружить не удалось. При исследовании извлечения из мочи крыс собранной в течение 24 ч методом ГХ/МС были обнаружены циклопентолат, нафазолин основания и их метабо-литы строение, которых установить не удалось.
При исследовании методом ТСХ наблюдались пятна по значению Rf, окраске и флюо-ресценции соответствующие циклопентолата и нафазолина оснований, выделенных из раст-воров препаратов (табл. 2).
Табл. 2. Хроматографическая подвижность нафазолина, тропикамида,
циклопентолата и других наркотических средств
Вещетво | Значение Rf | ||||
Нафазолин | Тропикамид | Циклопентолат | Кодеин | Морфин | |
0.12 | 0.6 | 0.23 | 0.42 | 0.36 | |
Хлороформ-ацетон-этанол-аммиака раствор (30:30:5:2) | 0.06 | 0.53 | 0.04 | 0.35 | 0.3 |
Метанол-аммиака раствор (100:1.5) | 0.14 | 0.74 | 0.12 | 0.37 | 0.32 |
Сухие остатки извлечений давали цветные и осадочные реакции с реактивами, представ-ленными выше, которые по характеру осадка и цвету проводимой реакции совпадали с данными полученными для стандартных образцов.
Исследование извлечений из биологических жидкостей проводили методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором проводили на оборудовании фирмы. Времена удерживания циклопентолата (кровь – 7.95; моча – 7.89 мин), нафазолина (кровь – 12.45; моча – 12.41 мин) и соответствовали временам удерживания стандартных образцов (СО) и отличались от СО тропикамида (16.3 мин).
Метод ВЭЖХ, на оборудовании фирмы Agilent c ДМД, колонка Zorbax Eclipse. Время удерживания циклопенталат (кровь – 6.22; моча – 6.25), нафазолин (кровь – 5.21 мин; моча – 5.24), что соответствует временам удерживания СО и отличаются от СО тропикамида – 4.25 мин,
Совпадали со СО и Уф спектры, записанные в хлористоводородной кислоте 0.1М раствор (циклопентилат – 252, 258, 264; нафазолин – 270, 280, 287, 291 н. м.).
Для количественного определения разработаны методики определения в биологических жидкостях циклопентолата основания: УФ спектрофотометрия (градуировочный график), ВЭЖХ (градуировочный график) и масс-спектрометрии (метод внутреннего стандарта); нафа-золина основания: УФ спектрофотометрия (градуировочный график), ВЭЖХ (градуировоч-ный график) и денситометрия. Расхождение в результатах количественного определения для изучаемых веществ, полученных разными методами, не превышает 5 % (табл. 3).
Табл. 3. Количественное определение циклопентолата и нафазолина оснований в биологических жидкостях после забора крови через 1 и 2 ч, мочи в течении 24 ч после введения препаратов
Метод | Концентрация в мкг/мл | |||||
Кровь через 1 ч | Кровь через 2 ч | Моча | ||||
Цикло- пентолат | Нафа- золин | Цикло- пентолат | Нафа- золин | Цикло- пентолат | Нафа- золин | |
Масс-спектрометрия | 8.75 | - | 3.32 | - | 14.8 | - |
ВЭЖХ при ЖЖЭ | 9.46 | 20.8 | 4.15 | 1.4 | 31.8 | 32.5 |
ВЭЖХ при ТФЭ | 17.6 | 31.3 | 5.9 | 2.2 | - | - |
УФ спектрофотометрия | 10.2 | 36.5 | 3.6 | 1.60 | 15.7 | 37.2 |
Денситометрия | - | 32.7 | - | 1.4 | - | 31.7 |
Для количественного определения циклопентолата и нафазолина оснований в биологи-ческих жидкостях методом ВЭЖХ были определены некоторые валидационные характерис-тики. Параметр линейности определяли путем измерения растворов исследуемых веществ на 5 уровнях концентраций. Значение коэффициента корреляции находилось в пределах 0.99 < R < 1.0. Прецизионность метода устанавливали по показателям сходимость и внутрилабора-торная воспроизводимость. Относительное стандартное отклонение при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышало 2.3% (при RSD < 3% изменчивость вариационного ряда считается незначительной), и полученные данные являются сходимыми, а методика воспроизводима.
Выводы
Изолирование из биожидкостей анализируемых веществ следует проводить жидкость-жид-костной экстракцией смесью хлороформ – 2-пропанол (9:1) при рН = 10 среды (цикло-пентолат основание) и нафазолина основания экстракцию из раствора боратного буфера (рН среды 9.18) хлороформом, после предварительного осаждения белков для крови и без предварительного кислотного гидролиза для мочи циклопентолата и кислотного гидролиза для нафазолина. Применение твердофазной экстракции увеличивает процент извлечения анализируемых оснований в 1.5-2 раза.Установлено, что методы: ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ, УФ спектрометрии позволяют идентифи-цировать компонент препаратов «Цикломед» и «Нафтизин» в биологических жидкостях.
Разработаны условия для количественного определения циклопентолата и нафазолина осно-ваний выделенных из биологических жидкостей, методами высокоэффективной жидкост-ной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии. УФ спектрометрии и денситометрии.
Для количественного определения циклопентолата и нафазолина оснований в биологичес-ких жидкостях методом ВЭЖХ были определены некоторые валидационные характе-ристики.
Литература
, Применение холинолитиков в немедицинских целях. , , , . Фармация. 2012. №2. С.51-53. , , О злоупотреблении циклопентолатом (цикломедом). Наркология. 2010. №10. С. 40-44. Отравления нафтизином [Электронный ресурс] Режим доступа – http://www. kaznmu/kz/press/2012/01/20/отравления-нафтизином/ Clarke`s analysis of drugs and Poisons. 4th Edition. A. C. Moffat, M. D. Osselton and B. Widdop. London: Pharmaceutical Press. 2011. 1632р. , , Тонкослойная хроматография в анализе некоторых противовоспалительных средств. Суд. мед. экспертиза. 2010. №5. С.25-30. , , Определение препарата нурофен-плюс в биологических жидкостях. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.32. №13. С.128-130. ROI: jbc-01/12-32-13-128 , , Химико-токсикологическое исследование некоторых нестероидных противовоспалительных средств. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №7. С.108-116. ROI: jbc-01/14-38-7-108 , , Изолирование лекарственных веществ из плазмы крови методом твердофазной экстракции. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.33. №1. С.35-42. ROI: jbc-01/14-38-7-108In the English version of this article, the Reference Object Identifier – ROI: jbc-02/16-47-8-139
Определение нафазолина (назальные капли нафтизин)
и циклопентолата (глазные капели цикломед)
в биологических жидкостях
© Киреева1 Анна Владимировна, Анисимова2 Наталия Аскольдовна
и Куклин2*+ Владимир Николаевич
1 КУЗ Ленинградской области Бюро судебно-медицинской экспертизы. г. Санкт-Петербург. Россия.
2 Кафедра фармацевтической химии. Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия.
Ул. Проф. Попова, Лит. А. г. Санкт-Петербург, 197376. Россия.
Тел.: (812) 234-13-59. E-mail: *****@***ru
___________________________________
*Supervising author; +Corresponding author
Keywords: нафазолин, циклопенилат идентификация, количественное определение.
Abstract
Определены оптимальные условия изолирования нафазолина и циклопенталата из биологи-ческих жидкостей нафазолин – хлороформом при рН 9.18 среды, циклопентилат – хлороформом – 2-пропанол (9:1) при рН 10 среды. Выделенные вещества и их метаболиты из биологических жид-костей идентифицировали с применением цветных и осадочных реакций, методами ИК, УФ спектро-скопии, тонкослойной, газовой хроматографией с масс-селективным детектором и высокоэффек-тивной хроматографией. Количественное определение в извлечениях из биологических жидкостей осуществляли методами ВЭЖХ хромато-денситометрией, УФ спектроскопией и хромато – массспект-рометрией. Результаты разных, методов сопоставимы.
В виду того, что перед журналом стоит задача вхождения в базу данных Scopus и Web of Science, то мы должны приводить структуру статей в соответствие с их требованиями. Одним из таких требований является наличие 250 слов в тексте аннотации. В этой связи просим Вас переписать аннотацию и перевести исправленный вариант на английский язык.
Количество слов в аннотации можно узнать в MS Word 2003 выделив текст, войти в информационной панели в Сервис и затем в Статистику. В MS Word 2007, выделяют весь текст аннотации и на нижней информационной панели нажимают на секцию “Число слов”, в возникшем статистическом окошке смотрят численное значение.
