Роль сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента в механизмах модулирования воспаления фенольными антиоксидантами (стр. 2 )

Использование ТС-13 как индуктора сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE впервые показало, что ее активация обладает выраженным протективным действием в отношении проявлений острого, но не хронического воспаления.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования существенно дополняют представления о механизмах патогенеза воспалительных процессов данными об участии в них редокс-чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE.

Полученные в ходе исследования структурно зависимого ряда водорастворимых монофенольных антиоксидантов данные позволяют рекомендовать 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в качестве перспективного средства дополнительной терапии состояний, связанных с избыточной активацией фагоцитирующих клеток, благодаря выявленному значимому противовоспалительному действию в отношении острых воспалительных процессов в сочетании с высокой скоростью развития данного эффекта. При этом результаты настоящего исследования свидетельствуют о необходимости дифференцированного подхода к противовоспалительной терапии с учётом фазы, стадии и степени выраженности процесса, в том числе в связи с большей эффективностью индукторов редокс-чувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE на ранних этапах развития воспаления.

Положения, выносимые на защиту

1.        Синтетические водорастворимые структурно подобные фенольные антиоксиданты способны индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE, выраженность эффекта зависит от химической структуры соединений. Наибольшую активность среди исследованных соединений проявляет частично экранированный 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13).

2.        Эффективный индуктор сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 обладает наиболее выраженной противовоспалительной активностью на модели острого локального воспаления по сравнению с другими исследованными структурно подобными соединениями.

3.        Противовоспалительное действие эффективного индуктора сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 более выражено в отношении острых, чем хронических иммуноопосредованных воспалительных процессов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Шестой международной крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Украина, Судак, 2010), VIII международной конференции "Биоантиоксидант" (Россия, Москва, 2010), 17-й Ежегодной конференции общества свободнорадикальной биологии и медицины (SFRBM's 17th Annual Meeting), (США, Орландо, 2010), 7-й научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2011), Седьмой международной крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Украина, Судак, 2011), Всероссийской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодежи "Живые системы и конструкционные материалы в условиях криолитозоны" (Якутск, 2011), Шестой Всероссийской научно-практической конференции "Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов" (Новосибирск, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав (включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, изложение собственных результатов и их обсуждение) заключения, выводов и списка 375 источников цитируемой литературы (31 отечественный и 344 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 7 таблицами, 36 рисунками и 1 схемой.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 09-04-00600) с использованием оборудования ЦКП "Современные оптические системы". Автор глубоко признательна за неоценимую помощь в работе, сотрудникам НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО НГПУ , за предоставленные оригинальные соединения.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты in vitro выполнены на макрофагоподобных клетках гистиоцитарной лимфомы человека U937, гистиоцитарной саркомы мыши J774 и фибробластах легкого эмбриона человека FLECH, полученных из ФГБУН Институт цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). В экспериментах in vivo использовали крыс линии Вистар массой 200–300 г и 6-недельных мышей (C57Bl6xDBA/2)F1 массой 18–24 г, полученных из Экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (г. Новосибирск).

Все спектрофотометрические исследования проводили на планшетном фотометре BioTek ELx808 (BioTek, США), проточную цитофлуориметрию выполняли на приборе FACSCalibur (Becton-Dickinson, США), анализ иммунофлуоресцентного окрашивания осуществляли на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM 710 (Zeiss, Германия), для хемилюминесцентных исследований применяли прибор ХЛМЦ-01 (г. Новосибирск).

Жизнеспособность клеток U937 под воздействием исследуемых соединений определяли спектрофотометрически в МТТ-тесте через 24 ч инкубации. Выраженность апоптоза и некроза при окислительном стрессе, индуцированном Н2О2, оценивали с помощью проточной флуориметрии по величине трансмембранного митохондриального потенциала (с использованием красителя DiOC6) и по проницаемости клеточной мембраны для PI соответственно.

Активность ферментов измеряли спектрофотометрически в лизатах клеток U937, приготовленных через 24 ч инкубации с исследуемыми соединениями: NQO1 – по скорости реакции NADPH-зависимого окисления дихлориндофенола, GST – по скорости образования конъюгатов глутатиона с динитрохлорбензолом, GR – по скорости окисления NADPH, расходующегося на восстановление GSSG. Изменение оптической плотности пересчитывали в изменение концентрации продукта, используя коэффициент экстинкции. После измерения количества белка по Брэдфорду в клеточном лизате активность фермента нормировали на общее количество белка, на основании чего делали вывод об изменении активности фермента.

Суммарное содержание глутатиона (GSH и GSSG) в лизатах клеток U937, приготовленных через 24 ч инкубации с исследуемыми соединениями, определяли спектрофотометрически по скорости его взаимодействия с 5,5’-дитиобис-2-нитробензойной кислотой, для измерения содержания GSSG каждую пробу предварительно инкубировали с 2,5% 2-винилпиридина для необратимой конъюгации GSH. Концентрацию GSH определяли как разность содержания суммарного и окисленного глутатиона.

Для определения локализации транскрипционного фактора Nrf2 клетки линий J774 и FLECH окрашивали с помощью поликлональных кроличьих антител к Nrf2 и вторичных антител к иммуноглобулинам кролика, конъюгированных с флуорохромом Texas Red, клеточные ядра контрастировали DAPI.

Продукцию АКМ лейкоцитами определяли в образце крови из хвостовой вены либо в образце воспалительного экссудата. цитофлуориметрических исследованиях использовали дихлородигидрофлуоресцеин и дигидроэтидин, окисляющиеся соответственно H2O2 до флуоресцентного дихлорфлуоресцина и супероксид-анионом до флуоресцентного этидина, дыхательный взрыв стимулировали PMA. При хемилюминесцентных исследованиях использовали люминол, дыхательный взрыв стимулировали частицами зимозана; одновременно определяли общее содержание лейкоцитов, на мазках крови подсчитывали лейкоцитарную формулу и выполняли расчет удельной интенсивности дыхательного взрыва.

Острое локальное воспаление (модель 1) индуцировали введением крысам линии Вистар интраплантарно в правую заднюю лапу 0,1 мл 10% раствора каррагинана ?, выраженность отека лапы определяли плетизмометрически через 5 ч. Тестируемые соединения вводили за 1 ч до инъекции каррагинана. В этой и последующих экспериментальных моделях использовали внутрижелудочное введение 1 мл растворов соединений в дозе 100 мг/кг массы тела животного (за исключением модели 3) с помощью зонда, контрольные животные аналогичным образом получали растворитель (дистиллированную воду).

Неспецифическое острое системное воспаление (модель 2) индуцировали однократным введением в латеральную хвостовую вену крысам линии Вистар 1 мл суспензии частиц зимозана (20 мг/мл) в 0,89% растворе NaCl. За 2 ч до этого и через 5 ч после животным опытной группы вводили раствор ТС-13, в последующем – дважды в день; на 2-й и 3-й день получали кровь из хвостовой вены и определяли продукцию АКМ (в диссертацию продублировать).

Эндотоксиновый шок (модель 3) вызывали внутрибрюшинным введением мышам (C57Bl6xDBA/2)F1 липополисахарида E. coli 055:B5, растворенного в 0,89% растворе NaCl, в дозе 1 мг на мышь, за 3 часа до инъекции животные опытной группы получали 0,1 мл раствора ТС-13 (200 мг/кг массы тела).

Для индукции обострения хронического воспаления использовали модель «воздушного мешка» ("air pouch") (модель 4): крысам линии Вистар 3 раза в течение 7 дней вводили от 20 до 10 мл стерильного воздуха под кожу в межлопаточной области, после чего в образовавшуюся воздушную полость делали инъекцию 2 мл 1% водного раствора каррагинана ?, через сутки исследовали воспалительный экссудат. Раствор ТС-13 вводили за 1 сутки, за 1 час до инъекции каррагинана и через 5 часов после.

Неспецифическое воспаление суставов лап самцов крыс Вистар (модель 5, ревматоидный полиартрит) индуцировали путем внутрикожной инъекции раствора гетерологичного бычьего коллагена типа II в смеси с адъювантом Фрейнда. Раствор ТС-13 вводили в день иммунизации и в последующем через день. Через каждые 7 суток после иммунизации плетизмометрически измеряли объем задних лап, начиная с 15 суток каждые 2–3 дня по 5-балльной системе определяли визуальные стадии артрита, на 32-й день животных умерщвляли и забирали кровь для определения количества и функциональной активности лейкоцитов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия между сравниваемыми величинами показателей различных экспериментальных групп считали достоверными при p < 0,05. Для определения достоверности различий между кривыми выживаемости животных опытной и контрольной групп, построенными по методу Каплана ? Майера, применяли логранговый тест.