Роль сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента в механизмах модулирования воспаления фенольными антиоксидантами (стр. 1 )

На правах рукописи

ЛЕМЗА

Анна Евгеньевна

РОЛЬ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТ-РЕСПОНСИВНОГО ЭЛЕМЕНТА В МЕХАНИЗМАХ
МОДУЛИРОВАНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫМИ
АНТИОКСИДАНТАМИ

14.03.03 – патологическая физиология

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск, 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном
учреждении «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научный руководитель:
доктор медицинских наук
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры фармакологии ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России
доктор биологических наук, в. н.с. лаборатории фармакологических исследований ФГБУН Новосибирский институт органической химии им. СО РАН

Ведущая организация: ГБОУ ВПО "Сибирский государственный
медицинский университет" Минздрава России (Томск)

Защита состоится «27»        мая         2014 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д. 001.048.01 в ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН
.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН и на сайте http://centercem. ru

Автореферат разослан «__» ______________ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из неотъемлемых признаков воспалительной реакции является активация фагоцитирующих клеток, микробицидную функцию которых обусловливают генерируемые ими активированные кислородные метаболиты (АКМ), сдвигающие окислительно-восстановительное равновесие клеток в сторону прооксидантов, что приводит к развитию окислительного стресса и может способствовать повреждению окружающих тканей. Наряду с этим большинство исследователей считает АКМ важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом изменения программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток [Brune B. et al., 2013], , в том числе посредством изменения активности редокс-чувствительных транскрипционных факторов [ и др., 2006].

Особое место среди редокс-чувствительных систем клетки занимает сигнальный путь Keap1/Nrf2, активирующий экспрессию генов за счет взаимодействия транскрипционного фактора Nrf2 с цис-регуляторным антиоксидант-респонсивным элементом (ARE). Главным назначением регуляторной системы Keap1/Nrf2/ARE является поддержание внутреннего гомеостаза при апоптоз-индуцирующих, проканцерогенных и стрессовых воздействиях [ и др., 2006; , 2013]. Исследования, проведенные на нокаутных по Nrf2 животных, выявляют важность ARE в процессах воспаления, канцерогенеза, фиброза, а также защиты от различных стрессовых воздействий [ и др., 2010]. Так, у мышей с выключенным геном Nrf2 более выражен воспалительный ответ на различные стимулы [Ma Q. et al., 2006], кроме того, Nrf2 способствует разрешению острых воспалительных процессов, препятствуя их хронизации [Reddy N. M. et al., 2009]. Биологическая важность ARE определяется тем, что от его активности зависит функционирование многих других редокс-чувствительных элементов, в том числе транскрипционных факторов NF-?B и АР-1, регулирующих развитие воспалительного процесса [Hayes J. D. et al., 2010; Wakabayashi N. et al., 2010], поэтому сигнальная система Keap1/Nrf2/ ARE считается перспективной мишенью при разработке новых противовоспалительных препаратов [Hybertson B. M. et al., 2011].

В научной литературе описан широкий спектр различных индукторов транскрипции генов, регулируемых ARE [Xiao H. Parkin K. L., 2006; Garbin U. et al., 2009], прежде всего это фенолы и хиноны, акцепторы Михаэля, серо - и селенсодержащие соединения. Большое внимание при исследовании новых стимуляторов ARE уделяется зависимости индуцирующей способности от структуры соединений: для фенолов существенно расположение ОН-групп [Prestera T. et al., 1993; Magesh S. et al., 2012] и степень их экранирования орто-заместителями [Takabe W. et al., 2006], для серо - и селен-содержащих соединений показана высокая активность диатомарной структуры –S-S - или - Se-Se - [Xiao H. et al., 2006]. Кроме того, важен вопрос биодоступности антиоксидантов, многие из которых липофильны. В отличие от гидрофильных веществ, жирорастворимые соединения при прохождении через желудочно-кишечный тракт взаимодействуют с желчными кислотами и их солями, кроме того, их всасывание в кишечнике происходит путём пассивного транспорта и зависит от наличия жиров в диете, что усложняет подбор дозировки и интервалов приёма. Для жирорастворимых соединений даже с доказанной высокой антиоксидантной активностью ведутся поиски водорастворимых аналогов или форм с целью повышения биодоступности [Yu H., 2011; Neves A. R. et al., 2013; Xiao Y. et al., 2013].

Ранее в системах in vitro была всесторонне изучена антирадикальная и антиоксидантная активность серосодержащих водорастворимых фенольных соединений, синтезированных в НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО "Новосибирский государственный педагогический университет" и представляющих собой экранированные трет-бутильными группами монофенолы с пара-пропильным заместителем сульфонатным или тиосульфонатным заместителем [ и др., 2001]. Антиоксидантный эффект соединений прямо зависел от степени экранирования ОН-группы и наличия атома двухвалентной серы в пара-пропильном заместителе. При этом если такая структурная зависимость чётко прослеживалась в случае простых бесклеточных и неферментативных систем, то при переходе к более сложным, в том числе клеточным и ферментативным тест-системам, связь структуры и активности соединения становилась менее однозначной, что, в частности, объяснялось их непрямым действием на регуляторную систему Keap1/Nrf2/ARE [ и др., 2007].

В соответствии с изложенным выше была сформулирована цель работы – изучить противовоспалительную активность новых синтетических водорастворимых фенольных антиоксидантов и исследовать ее возможную связь со способностью соединений индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи.

1.        Изучить влияние структурно подобных фенольных антиоксидантов на жизнеспособность моноцито/макрофагоподобных клеток линии U937 in vitro.

2.        Изучить особенности и специфичность активации антиоксидантных ферментов и ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков, контролируемых антиоксидант-респонсивным элементом, in vitro с помощью 5 синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов с выявлением наиболее эффективного соединения.

3.        В условиях целого организма на модели острого локального воспаления путем скрининга 10 синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов выявить соединение с наиболее выраженным противовоспалительным действием.

4.        Исследовать способность наиболее активного соединения индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента in vitro, изучив его влияние на внутриклеточное распределение транскрипционного фактора Nrf2 в макрофагоподобных клетках линии J774 и фибробластах линии FLECH.

5.        Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие и течение воспалительного процесса на моделях острого воспаления (внутривенное введение зимозановых частиц, эндотоксиновый шок).

6.        Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие воспалительного процесса на моделях хронического воспаления ("воздушный мешок", коллаген-индуцированный артрит).

Научная новизна работы

На клетках линии U937 показано, что все соединения нового ряда структурно зависимых водорастворимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов малотоксичны, за исключением селенсодержащего аналога, а 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в малых концентрациях увеличивает жизнеспособность клеток как в нормальных условиях, так и при индукции окислительного стресса за счёт ингибирования апоптоза.

На клетках линии U937 показана способность новых синтетических монофенольных антиоксидантов активировать контролируемые антиоксидант-респонсивным элементом ферменты NAD(P)H:хиноноксидоредуктазу 1 и глутатион-S-трансферазы, выявлена зависимость индуцирующего эффекта от структуры соединений: для реализации биологической активности исследуемых соединений важно присутствие в структуре пара-алкильного заместителя атома двухвалентной серы и степень экранирования ОН-группы. Наибольшим эффектом обладает ТС-13, для которого на клеточных линиях J774 и FLECH получено прямое доказательство способности активировать редокс-чувстви–тельную сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, а именно дозозависимая индукция транслокации транскрипционного фактора Nrf2 из цитоплазмы в ядро.

Впервые на модели острого каррагинан-индуцированного локального воспаления у крыс выявлена зависимость между химической структурой водорастворимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов и способностью ингибировать развитие отёка лапы, максимальная противовоспалительная активность показана для ТС-13. Установлено, что ТС-13 обладает выраженным протективным действием в отношении острого системного воспаления, способствуя угнетению генерации гранулоцитами крови АКМ. Однако применение ТС-13 при моделировании хронического воспаления (индуцированный гетерологичным коллагеном полиартрит) и его обострения (модель "воздушного мешка") способствовало снижению выраженности клинических признаков воспалительной реакции лишь на ранних стадиях, в то время как на более поздних стадиях его эффект проявлялся лишь в уменьшении активности и снижении праймированности к наработке АКМ нейтрофилов и моноцитов.