Роль сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента в механизмах модулирования воспаления фенольными антиоксидантами (стр. 3 )

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящей работе исследован ряд структурно взаимосвязанных водорастворимых фенольных соединений, в различной степени оказывающих, как показано в более ранних работах [ и др., 2007], антиоксидантный эффект (за исключением незамещённого метоксилированного фенола С-10), зависящий от наличия атома двухвалентной серы и степени экранирования ОН-группы. Таким образом, это группа соединений, одновременно проявляющих антиоксидантные свойства и обладающих признаками сразу трёх классов индукторов системы антиоксидант-респонсивного элемента (фенолы, акцепторы Михаэля, серосодержащие соединения), что позволяет предполагать у них наличие ARE-индуцирующего действия. Наиболее перспективным представителем этого ряда соединений является ТС-13, проявляющий бифункциональное антиоксидантное действие, обусловленное наличием в пара-алкильном заместителе активной серы. Кроме того, частичное экранирование ОН-группы трет-бутильным заместителем увеличивает стабильность соединения при небольших пространственных затруднениях: природных соединений аналогичного строения не существует в связи с отсутствием в живых организмах трансфераз, способных переносить трет-бутильные группы на бензольное кольцо [ и др., 2003].

Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на жизнеспособность клеток в культуре. Установлено, что, за исключением селенсодержащего аналога, все соединения представленного ряда структурно зависимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов обладают невысокой токсичностью, а ТС-13 в малых концентрациях способен даже увеличивать жизнеспособность клеток как в нормальных условиях (рисунок 1), так и при развитии окислительного стресса за счёт ингибирования апоптоза рисунок 2).

Изучение способности исследуемых фенольных антиоксидантов индуцировать ARE-зависимые ферменты в культуре клеток. Сравнительный анализ способности фенольных антиоксидантов представленного ряда индуцировать синтез ARE-зависимых ферментов II фазы детоксикации ксенобио­

Рисунок 1. Влияние ТС-13 на жизнеспособность клеток линии U937.

Рисунок 2. Влияние ТС-13 на выживаемость клеток U937 через 24 ч после добавления цитотоксической концентрации H2O2 по результатам МТТ-теста. По оси абсцисс – концентрация ТС-13; обозначены статистически значимые отличия (p < 0,05) от величин соответствующих показателей: # – интактных клеток (культивируемых без H2O2), * – клеток, культивируемых с H2O2 в отсутствие ТС-13.

тиков и антиоксидантных ферментов, оцененный на основе их влияния на активность GST и NQO1, показал, что способность к активации данных энзимов у исследуемых соединений существенно различается и зависит от их химической структуры. Наибольшим стимулирующим эффектом обладал ТС-13, в концентрации 20 мкМ увеличивая активность GST и NQO1 в 1,86 и 2,31 раза соответственно, в то время как для соединений, отличающихся от него полным экранированием функциональной группы, укороченным на одно метиленовое звено пара-алкильным заместителем, отсутствием бивалентного атома серы или заменой его на атом селена (II), была характерна частичная (от умеренной до почти полной) потеря биологической активности. Эти данные свидетельствуют о том, что для реализации биологической активности исследуемых соединений важна степень экранирования ОН-группы и присутствие атома двухвалентной серы в структуре пара-алкильного заместителя. Предположение об индукции именно синтеза ферментов (т. е. экспрессии соответствующих генов) как механизма их активации основано на свойстве большинства представленных фенолов полностью гидролизироваться в водных растворах уже через сутки, что исключает возможность аллостерического влияния на сами ферменты. Способность же индуцировать экспрессию зависимых от антиоксидант-респонсивного элемента генов антиоксидантами, структура которых отвечает критериям индукторов ARE, косвенно подтверждает их активирующее влияние на сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, об этом же свидетельствует наличие тесной корреляции между NQO1- и GST-индуцирующими способностями тестируемых соединений.

Влияние исследуемых фенольных антиоксидантов на развитие острого локального воспаления in vivo (модель 1). В результате проведённого с целью выявления соединения с наиболее выраженными противовоспалительными свойствами скрининга синтезированных фенолов в модели каррагинан-индуцированного отёка лап крыс линии Вистар обнаружено, что хотя практически все тестируемые соединения обладают способностью оказывать достоверно значимый противовоспалительный эффект, выраженность её зависит от химического строения антиоксидантов: у соединений с укороченным пара-алкильным заместителем, инактивированной функциональной группой или заменой активного атома серы на селен способность ингибировать развитие отёка лапы практически отсутствовала (рисунок 3). Очевидно, что исследуемые соединения ингибируют лишь часть из множества процессов и реакций, протекающих в ходе развития такого многокомпонентного процесса как воспаление. В то же время многие из этих процессов находятся под контролем фактора NF-?B, провоспалительные эффекты которого способна подавлять система Keap1/Nrf2/ARE, что позволяет предложить способность синтезированных фенольных антиоксидантов индуцировать эту систему как основу их противовоспалительного действия.

На основании полученных данных для дальнейшей работы был выбран частично экранированный ТС-13, обладающий максимально выраженными биологическими эффектами при умеренно выраженной токсичности.

Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента

Так как основным триггерным механизмом индукции системы Keap1/Nrf2/ARE является сдвиг редокс-баланса в биологических системах в сторону прооксидантов, а наиболее адекватным его показателем служит соот­

Рисунок 3. Влияние фенольных антиоксидантов на выраженность воспалительной реакции.

ношение восстановленных и окисленных SH-групп в белках, напрямую зависящее от системы глутатиона, было изучено влияние ТС-13 на эту систему. Показано, что ТС-13 способен оказывать дозозависимое стимулирующее действие на глутатионредуктазу (GR), проявляя при этом характерный для многих индукторов системы Keap1/Nrf2/ARE горметический эффект и увеличивать содержание общего глутатиона в клетках (в основном за счёт его восстановленной формы GSH), тем самым формируя тенденцию к увеличению соотношения восстановленного и окисленного глутатиона (GSSG) (рисунок 4).

Все полученные в ходе исследования данные косвенно свидетельствовали о способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента, для подтверждения которой была изучена способность ТС-13 инициировать ядерную транслокацию молекулы Nrf2, являющуюся ключевым моментом активации системы Keap1/Nrf2/ARE. Было показано, что под действием ТС-13 происходит перераспределение внутриклеточного пула Nrf2 с преимущественным накоплением его в ядре, эффект зависел от дозы. Полученные результаты, таким образом, подтверждают предполагавшуюся способность фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, которая, наиболее вероятно, и является основной его цитопротекторных свойств. Кроме того обнаруженная индуцирующая активность носит универсальный характер, хотя для разных типов клеток дозовая зависимость неоднозначна и наиболее явно проявляется в случае мононуклеарных фагоцитов (рисунок 5).

Рисунок 4. Влияние ТС-13 на активность GR (А), внутриклеточное содержание общего глутатиона (Б), GSH (В) и соотношение GSH/GSSG (Г).

Влияние фенольного антиоксиданта ТС-13 на развитие острого системного асептического воспаления in vivo (модель 2). Влияние индуцирующего систему Keap1/Nrf2/ARE действия ТС-13 на воспалительный процесс было рассмотрено в нескольких модельных системах in vivo, помимо уже описанного эффекта на острое локальное воспаление.

Рисунок 5. Влияние ТС-13 на изменение ядерно-цитоплазматического соотношения содержания Nrf2 в клетках J774 (А) и FLECH (Б).

На модели зимозан-индуцированного острого системного асептического воспаления было установлено, что индукция ARE замедляла повышение до статистически значимого уровня общего содержания лейкоцитов в крови (которое в данной модели является основным показателем развития острого системного воспаления) и способствовала ускорению снижения концентрации гранулоцитов, которая уже на третьи сутки после индукции воспаления была ниже, чем у животных контрольной группы (рисунок 6).

Рисунок 6. Влияние ТС-13 на количество лейкоцитов (А) и гранулоцитов (Б) периферической крови крыс в динамике острого системного воспалительного процесса. Здесь и на рис. 7–10 светлые символы – контроль, темные – ТС-13; # – p < 0,05 по сравнению с исходным значением, принятым за 100%, * р < 0,05 – по сравнению с контролем.

Индуцирующее действие ТС-13 не влияло на показатели объёмной плотности таких деструктивных изменений как некроз и дистрофия, но способствовало значимому (на 47 %) снижению объёмной плотности инфильтратов в печени животных. Кроме того, индукция ARE фенольным антиоксидантом приводила к существенному снижению спонтанной продукции АКМ гранулоцитами крови и способности клеток к развитию индуцированного как корпускулярными (зимозан), так и растворимыми (РМА) стимуляторами дыхательного взрыва (рисунок 7).

Рисунок 7. Влияние ТС-13 на интенсивность спонтанной генерации АКМ (А, Б) и дыхательного взрыва (В, Г) гранулоцитов периферической крови крыс, определяемой с помощью хемилюминесценции (А, В) и проточной цитофлуориметрии (Б, Г), в динамике острого системного воспалительного процесса.