Роль сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента в механизмах модулирования воспаления фенольными антиоксидантами (стр. 4 )

Таким образом, флоголитический эффект ТС-13 в отношении острого системного воспаления реализуется как путём непосредственно подавления генерации АКМ гранулоцитами, являющимися основными эффекторами острого воспаления, так и вследствие угнетения провоспалительной активности макрофагов/моноцитов и их способности праймировать гранулоциты к развитию дыхательного взрыва. Доказанная способность ТС-13 индуцировать систему Keap1/Nrf2/ARE и наличие сильной обратной корреляции между транскрипционной активностью NF-?B и Nrf2 в мононуклеарных фагоцитах позволяет предположить, что действие ТС-13 на циркулирующий пул гранулоцитов опосредовано снижением активности NF-?B в моноцитах и макрофагах, что сопровождается ингибированием синтеза провоспалительных цитокинов, праймирующих нейтрофилы. Хотя в данном случае исключать прямое влияние ТС-13 на полиморфноядерные лейкоциты также нельзя.

Влияние фенольного антиоксиданта ТС-13 на развитие острого системного септического воспаления in vivo (модель 3). На основании полученных на предыдущем этапе работы результатов было высказано предположение, что активация системы Keap1/Nrf2/ARE может оказывать протективное действие и при липополисахарид-индуцированном летальном эндотоксиновом шоке. Проведённое исследование подтвердило предполагаемый эффект: смертность животных, получавших ТС-13, была достоверно ниже, чем мышей контрольной группы (рисунок 8).

Вероятнее всего, индукция сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE водорастворимым фенольным антиоксидантом ТС-13 обладает существенным защитным действием в отношении септического шока, индуцированного введением бактериального эндотоксина, за счет снятия эффектов, опосредуемых редокс-чувствительным транскрипционным фактором NF-?B, и уменьшения выраженности дыхательного взрыва фагоцитов. Важно отметить высокую скорость наступления эффекта.

Рисунок 8. Влияние приема раствора ТС-13 на выживаемость мышей после индукции эндотоксинового шока.

Таким образом, учитывая полученные ранее данные о способности индуктора системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 подавлять развитие каррагинан-индуцированного отёка лапы, можно сделать вывод о выраженном протективном действии редокс-чувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE в отношении острых воспалительных процессов in vivo, способствующем снижению продукции АКМ и выраженности окислительного стресса, осуществляемом, в том числе, через угнетение системы провоспалительного редокс-чувствительного фактора NF-?B.

Влияние фенольного антиоксиданта ТС-13 на развитие обострения хронического воспаления (модель 4). На модели обострения хронического воспаления ("air pouch", "воздушный мешок") было установлено, что индукция системы Keap1/Nrf2/ARE фенольным антиоксидантом ТС-13 не влияет на объем воспалительного экссудата, содержание в нём белка и клеточных элементов, но статистически значимо снижает способность этих клеток к наработке АКМ, как спонтанной, так и при развитии дыхательного взрыва под действием корпускулярных и растворимых стимуляторов (рисунок 9).

Рисунок 9. Влияние ТС-13 на интенсивность спонтанной генерации АКМ (1, левые оси ординат) и дыхательного взрыва (2, правые оси ординат) клеток экссудата, определяемой с помощью хемилюминесценции (А) и проточной цитфлуориметрии (Б), при моделировании воспаления в "воздушном мешке".

Таким образом, функциональная активность лейкоцитов, мигрировавших в очаг воспаления, была закономерно снижена, тогда как проявления воспалительной реакции, зависящие от состояния эндотелиального барьера, оказались неизмененными, что позволяет считать основной мишенью противовоспалительного действия фенольных антиоксидантов, активирующих ARE, гранулоциты крови и, возможно, праймирующие их макрофаги.

Влияние фенольного антиоксиданта ТС-13 на развитие неспецифического аутоиммунного воспаления суставов (полиартрит; модель 5). С целью оценки способности системы Keap1/Nrf2/ARE влиять на выраженность неспецифического воспаления суставов лап самцов крыс Вистар и генерацию АКМ клетками-эффекторами воспаления была использована модель индуцированного гетерологичным коллагеном ревматоидного артрита, степень тяжести которого коррелировала с уменьшением прироста массы тела крыс, поскольку развитие данного поражения сопряжено с многократным усилением синтеза и секреции TNF-? (наиболее явно эта зависимость проявилась ближе к концу эксперимента). Была обнаружена тесная взаимосвязь между выраженностью прироста размеров обеих конечностей и стадией воспаления. Наиболее явные различия между крысами опытной и контрольной групп проявились на начальных стадиях патологического процесса, когда на 15 и 18 сутки после иммунизации показатель средней визуальной стадии воспаления на пораженную конечность был достоверно ниже в опытной группе, чем в контрольной (рисунок 10).

Рисунок 10. Динамика изменения визуальных признаков воспаления в ходе развития ревматоидного артрита у крыс, получавших раствор ТС-13 () и воду ().

На 32-е сутки эксперимента крысы в опыте и контроле не различались по содержанию лейкоцитов и гранулоцитов крови, как не было различий и по способности лейкоцитов генерировать АКМ. Но интенсивность дыхательного взрыва гранулоцитов крови значимо коррелировала как с увеличением объемов обеих задних конечностей, так и со стадией воспаления, что подтверждает праймированность клеток в ходе развития артрита. При детальном рассмотрении отдельных компонентов АКМ-синтезирующей функции фагоцитов было установлено, что праймированность моноцитов к наработке H2O2 у животных, получавших ТС-13, достоверно ниже, чем в контроле (в 1,68 раза, p < 0,05), а активация и праймированность нейтрофилов имеет тенденцию к уменьшению (спонтанная генерация H2O2 снижена в 1,4 раза, индуцированная PMA – в 1,56 раза по сравнению с контролем (р = 0,062)).

На основании полученных данных можно заключить, что на ранних стадиях развития аутоиммунного полиартрита индукция системы Keap1/Nrf2/ARE оказывает защитное действие, проявляющееся в снижении выраженности воспалительной реакции. На более поздних стадиях противовоспалительный эффект активации редокс-чувствительной системы проявлялся в снижении активности и праймированности к генерации АКМ нейтрофилов и, в большей степени, моноцитов.

Таким образом, в случае хронического воспаления клинические признаки воспаления (отек, покраснение, миграция гранулоцитов) практически не изменялись при активации ARE индуктором ТС-13, несколько уменьшаясь лишь на начальных этапах. И даже выявленное снижение окислительного метаболизма лейкоцитов, клеток-эффекторов и модуляторов воспаления, не влияет существенно на выраженность процесса.

Полученные данные свидетельствуют о выраженном флоголитическом действии редокс-чувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE в отношении острых воспалительных процессов и её участии только в предупреждении заболевания при развитии хронического воспаления, когда иммунный компонент является преобладающим.

ВЫВОДЫ

1.        Исследованные структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные антиоксиданты обладают невысокой токсичностью (за исключением селенсодержащего аналога СС-13) при тестировании в культурах моноцито/макрофагоподобных клеток линии U937 in vitro, по степени увеличения токсичности располагаясь в ряд: ТС-13 > ТС-12 > ТС-17 = С-13 > СС-13. Единственное соединение из протестированных, 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС-13), в низких концентрациях (100 и 200 мкМ) увеличивает жизнеспособность клеток, что, очевидно, связано с его способностью ингибировать апоптоз.

2.        Структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные антиоксиданты обладают различной способностью активировать ферменты, контролируемые системой антиоксидант-респонсивного элемента, выраженность эффекта в наибольшей степени определяется степенью экранирования фенольной группы и наличием атома двухвалентной серы в пара-алкильном заместителе. Максимальную эффективность из исследованных соединений проявляет 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в концентрации 20 мкМ, увеличивая активность глутатион-S-трансфераз и NAD(P)H:хиноноксидоредуктазы 1 в 1,86 и 2,31 раза соответственно.

3.        ТС-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия) в моноцитарно-макрофагальной клеточной культуре J774 и культуре фибробластов FLECH дозозависимо (с максимальным эффектом при концентрации 20 мкМ) индуцирует транслокацию молекулы Nrf2 в ядро, что служит прямым доказательством его участия в индукции системы антиоксидант-респонсивного элемента.

4.        Структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные антиоксиданты оказывают противовоспалительное действие в отношении острого воспаления на модели отека лапы. Максимальной дозозависимой активностью из исследованных соединений обладает 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС-13), ED50 = 26 мг/кг массы тела. ТС-13 также эффективен в отношении проявлений острого системного асептического воспаления и эндотоксинового шока при назначении в дозах 100 и 200 мг/кг массы тела животного соответственно. Очевидно, защитное действие ТС-13 в отношении исследованных проявлений острых воспалительных процессов связано со способностью соединения индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента.

5.        Протективный эффект индуктора системы антиоксидант-респонсивного элемента 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфоната натрия (ТС-13) в отношении визуальных проявлений клинических признаков хронического воспаления (модели "воздушного мешка" и коллаген-индуцированного артрита) менее выражен, чем при остром воспалении, при этом применение этого соединения в дозе 100 мг/кг массы тела сопровождалось снижением продукции активированных кислородных метаболитов фагоцитирующими клетками.

6.        ТС-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия) может служить перспективным средством дополнительной терапии состояний, связанных с избыточной активацией фагоцитирующих клеток, за счет выраженной активности при острых воспалительных процессах и высокой скорости наступления эффекта.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Защитное действие ARE-индуцирующего фенольного антиоксиданта ТС-13 при хроническом воспалении / , , // Бюл. эксперим. биол. мед. ? 2013. ? Т. 155, № 3. ? С. 305-309. (Из списка ВАК). Противовоспалительная активность индуцирующего систему антиоксидант-респонсивного элемента (ARE) фенольного антиоксиданта ТС-13 / , , // Бюл. эксперим. биол. мед. ? 2013. ? Т. 155, № 3. ? С. 344-348 (Из списка ВАК). Водорастворимый фенольный антиоксидант ТС-13 обладает цитопротекторными свойствами при окислительном стрессе / , , // Кислород и антиоксиданты.– 2010.– вып. 2.– С. 9–10. Влияние водорастворимого фенольного антиоксиданта ТС-13 на системное воспаление / , , // Кислород и антиоксиданты.– 2010.– вып. 2.– С. 67–68. Связь противовоспалительных свойств водорастворимых фенольных антиоксидантов с активацией ими антиоксидант-респонсивного элемента ARE / , , // Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии: Тезисы Шестой междунар. конф., Судак, 20–29 сентября 2010 г.– Судак, 2010.– С. 43. Исследование противовоспалительных свойств фенольных серосодержащих антиоксидантов на модели воздушного мешка / , , // Биоантиоксиданты: Тезисы докл. VIII междунар. конф., Москва, 4–6 октября 2010 г.– М., 2010.– С. 254–256. Возможный механизм активации Nrf2/ARE фенольными серосодержащими антиоксидантами за счет образования дисульфидов / , , // Биоантиоксидант: Тезисы докл. VIII междунар. конф., Москва, 4–6 октября 2010 г.– М., 2010.– С. 462–463. Antioxidant response element activating sulfur-containing monophenols as novel anti-inflammatory agents / V. Tkachev, E. Menshchikova, N. Zenkov, N. Zaitseva, A. Lemza, T. Sharkova, N. Kandalintseva, S. Yagunov // Free Radic. Biol. Med. – 2010.– Vol. 49, Suppl. 1.– P. S149. Antioxidant responsive element as molecular target of novel water-soluble phenolic antioxidants anti-inflammatory action / V. Tkachev, E. Menshchikova, N. Zenkov, N. Zaitseva, A. Lemza, T. Sharkova, N. Kandalintseva, S. Yagunov // Proc. Annual Meet. SFRR/EEMS, September 12–15, 2010.– Oslo, 2010.– P. 221–222. Окислительный стресс при воспалении и его коррекция фенольными антиоксидантами / // Материалы XLIX международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» Биология, 16-20 апреля 2011 г. – Новосибирск, 2011. – С. 24. Selectivity of ARE-inducing phenolic antioxidant TS-13 anti-inflammatory effect / E. B. Menshchikova, N. K. Zenkov, V. O. Tkachev, A. E. Lemza, N. V. Kandalintseva // Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants and Human Health: proc. 7th Nat. Sci. Pract. Conf. Int. Particip., Smolensk, September 14–18.– Smolensk, 2011.– P. 176–177. Возможность антиоксидантной терапии воспалительных процессов / , Н. К, Зенков, , // Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии: Тезисы докл. Седьмой междунар. крымской конф., Судак, 22–30 сентября 2011 г.– М., 2011.– С. 27. Противовоспалительный эффект индуктора редокс-чувствительной системы Nrf2/Keap1/ARE / , Н. К, Зенков, , // Живые системы и конструкционные материалы в условиях криолитзоны: Сб. трудов Всерос. научно-практич. конф. с элементами научной школы для молодежи, 11–12 ноября 2011 г. – Якутск, 2011. – С. 74–81. Влияние непрямого антиоксидантного воздействия на развитие острого и хронического воспаления / , , // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы Шестой Всерос. научно-практич. конф., 16–17 апреля 2013 г. – Новосибирск, 2013. – С. 92–93.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКМ        активированные кислородные метаболиты

ARE                антиоксидант-респонсивный элемент

DAPI        4',6-диамино-2-фенилиндол

DiOC6        3,3'-дигексилоксакарбоцианин йодид,

GR                глутатионредуктаза

GSH        восстановленная форма глутатиона

GSSG        окисленная форма глутатиона

GST        глутатион-S-трансферазы

MTT        бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия

NQO1        NAD(P)H:хиноноксидоредуктаза

PBS                фосфатно-солевой буфер

PI        йодид пропидия

PMA        форбол-12-миристат-13-ацетат

tBHQ        трет-бутилгидрохинон

Соискатель