Водорастворимые витамины и витаминоподобные соединения

Раздел II Водорастворимые витамины и витаминоподобные соединения

1. Физико-химические свойства.

2. Физиологические свойства.

3. Обмен витамина в организме человека и животных.

4. Потребность в витамине и  содержание в пищевых продуктах.

5. Характеристика гипо - и авитаминозов.

6. Методы определения витамина.

Витамин B1?тиамин

Антиневритный витамин

Физико-химические свойства витамина В1. Физиологические свойства витамина В1 (участие в обменных процессах, влияние на нервную, сердечно-сосудистую систему, на органы пищеварения, кроветворения). Обмен витамина В1 в организме человека и животных. Потребность в витамине В1 и его содержание в пищевых продуктах. Естественные источники. Характеристика В1-гипо - и авитаминозов. Методы определения витамина В1 в биологических жидкостях, тканях, продуктах питания.

Химическое строение и свойства

Витамин В1 был первым витамином, выделенным в кристаллическом виде К. Функом в 1912 г. Позже был осуществлен его химический синтез. Свое название — тиамин — получил из-за наличия в составе его молекулы атома серы и аминогруппы.

Тиамин состоит из 2-х гетероциклических колец — аминопирими - динового и тиазолового. Последнее содержит каталитически активную функциональную группу — карбанион (относительно кислый углерод между серой и азотом).

Тиамин хорошо сохраняется в кислой среде и выдерживает нагревание до высокой температуры. В щелочной среде, например при выпечке теста с добавлением соды или карбоната аммония, он быстро разрушается.

Метаболизм. В желудочно-кишечном тракте различные формы ви­тамина гидролизуются с образованием свободного тиамина. Большая часть тиамина всасывается в тонком кишечнике с помощью специфического механизма активного транспорта, остальное его количество расщепляется тиаминазой кишечных бактерий. С током крови всосавшийся тиамин попадает вначале в печень, где фосфорилирует ся тиаминпирофосфокиназой, а затем переносится в другие органы и ткани.

Существует мнение, что основной транспортной формой тиамина является ТМФ тиаминмонофосфат.

Витамин В: присутствует в различных органах и тканях как в форме свободного тиамина, так и его фосфорных эфиров: тиаминмонофосфата (ТМФ), тиаминдифосфата (ТДФ, синонимы: тиаминпирофосфат, ТПФ, кокарбоксилаза) и тиаминтрифосфата (ТТФ).

Основной коферментной формой (60-80% от общего внутрикле­точного) является ТПФ.

ТТФ играет важную роль в метаболизме нервной ткани. При нару­шении его образования развивается некротизирующая энцефалопатия.

После распада коферментов свободный тиамин выделяется с мочой и определяется в виде тиохрома.

Биохимические функции. Витамин В1 в форме ТПФ является состав­ной частью ферментов, катализирующих реакции прямого и окислительного декарбоксилирования кетокислот.

Участие ТПФ в реакциях декарбоксилирования кетокислот объясняется необходимостью усиления отрицательного заряда углеродного атома карбонила кетокислоты в переходном, нестабильном, состоянии:

Переходное состояние стабилизируется ТПФ путем делокализации отрицательного заряда карбаниона тиазолового кольца, играющего роль своеобразного электронного стока. Вследствие такого протонирования образуется активный ацетальдегид (гидроксиэтил-ТПФ).

Аминокислотные остатки белков обладают слабой способностью осуществлять то, что с легкостью делает ТПФ, поэтому апобелки нуждаются в коферменте. ТПФ жестко связан с апоферментом мультиферментных комплексов дегидрогеназ а-оксикетокислот (см. ниже).

1. Участие ТПФ в реакции прямого декарбоксилирования пировино - градной кислоты (ПВК). При декарбоксилировании ПВК с помощью пируватдекарбоксилазы образуется ацетальдегид, который под воздействием алкогольдегидрогеназы превращается в этанол. ТПФ является незаменимым кофактором пируватдекарбоксилазы. Этим ферментом богаты дрожжи.

2.Участие ТПФ в реакциях окислительного декарбоксилирования.

Окислительное декарбоксилирование ПВК катализирует пируватде - гидрогеназа. В состав пируватдегидрогеназного комплекса входит несколько структурно связанных ферментных белков и коферментов. ТПФ катализирует начальную реакцию декарбоксилирования ПВК. Эта реакция идентична катализируемой пируватдекарбоксилазой. Однако в отличие от последней, пируватдегидрогеназа не превращает промежуточный продукт гидроксиэтил-ТПФ в ацетальдегид. Вместо этого гидроксиэтильная группа переносится к следующему ферменту в мультиферментной структуре пируватдегидрогеназного комплекса.

Окислительное декарбоксилирование ПВК является одной из клю­чевых реакций в обмене углеводов. В результате этой реакции ПВК, образовавшаяся при окислении глюкозы, включается в главный ме­таболический путь клетки — цикл Кребса, где окисляется до углекислоты и воды с выделением энергии. Таким образом, благодаря реакции окислительного декарбоксилирования ПВК создаются условия для полного окисления углеводов и утилизации всей заключенной в них энергии. Кроме того, образующаяся при действии ПДГ-комплек са активная форма уксусной кислоты служит источником для синтеза многих биологических продуктов: жирных кислот, холестерина, стероидных гормонов, ацетоновых тел и других.

Окислительное декарбоксилирование а-кетоглутатарата катализирует а-кетоглутаратдегидрогеназа. Этот фермент является составной частью цикла Кребса. Строение и механизм действия а-кетоглутарат - дегидрогеназного комплекса схожи с пируватдегидрогеназой, т. е. ТПФ также катализирует начальный этап превращения кетокислоты. Таким образом, от степени обеспеченности клетки ТПФ зависит бесперебойная работа этого цикла.

Помимо окислительных превращений ПВК и а-кетоглутарата, ТПФ принимает участие в окислительном декарбоксилировании кетокислот с разветвленным углеродным скелетом (продукты дезаминирования валина, изолейцина и лейцина). Эти реакции играют важную роль в процессе утилизации аминокислот и, следовательно, белков клеткой.

ТПФ — кофермент транскетолазы. Транскетолаза — фермент пентозофосфатного пути окисления углеводов. Физиологическая роль этого пути заключается в том, что он является основным поставщиком NADFH-H+ и рибозо-5-фосфата. Транскетолаза переносит дву углеродные фрагменты от ксилулозо-5-фосфата к рибозо-5-фосфату, что приводит к образованию триозофосфата (3-фосфоглицеринового альдегида) и 7С сахара (седогептулозо-7-фосфата). ТПФ необходим для стабилизации карбаниона, образующегося при расщеплении связи С2— С3 ксилулозо-5-фосфата. Витамин В1 принимает участие в синтезе ацетилхолина, катализируя в пируватдегидрогеназной реакции образование ацетил-КоА — субстрата ацетилирования холина. Помимо участия в ферментативных реакциях, тиамин может вы­полнять и некоферментные функции, конкретный механизм которых еще нуждается в уточнении. Полагают, что тиамин участвует в кроветворении, на что указывает наличие врожденных тиаминзависимых анемий, поддающихся лечению высокими дозами этого витамина, а также в стероидогенезе. Последнее обстоятельство позволяет объяснить некоторые эффекты препаратов витамина В1 как опосредованных стресс-реакцией.

Гиповитаминоз. Уже ранние проявления гиповитаминоза сопровож­даются снижением аппетита и тошнотой. Отмечаются неврологические расстройства, к которым относятся нарушение периферической чувствительности, ощущение «ползания мурашек», невралгии. Характерна забывчивость, особенно на недавние события. Слабость сердечной мышцы проявляется тахикардией даже при незначительных нагрузках.

Недостаток в пище тиамина приводит к значительному накоплению пировиноградной и а-кетоглутаровой кислот, снижению активности тиаминзависимых ферментов в крови и тканях организма.

Экспериментально доказано, что тиаминовая недостаточность со­провождается нарушением структуры и функции митохондрий. Добавление к последним ТПФ нормализует тканевое дыхание. У белых крыс, лишенных тиамина, развивалась анорексия, уменьшалась масса тела. Шерсть теряла свой блеск, становилась взъерошенной. Животные мало двигались и обычно лежали, свернувшись в углу клетки. Анорексия является результатом резкого угнетения секреции желудочного сока и ослабления его переваривающей способности.

Алиментарная недостаточность тиамина у человека приводит к па­тологическим изменениям в нервной, сердечно-сосудистой и пище­варительной системах, сопровождаясь общим истощением организма.

Болезнь бери-бери возникает при значительном дефиците тиамина и характеризуется крайне тяжелым течением. В прошлом веке в странах Востока она унесла миллионы жизней. Бери-бери в переводе с индийского означает «овца». Походка больного, действительно, похожа на поступь овцы (симптом симметричного опускания стоп). Поскольку у заболевших отмечалась тяжесть в ногах и скованность походки, бери-бери называлась также кандальной болезнью. Этим заболеванием часто страдали заключенные, рацион питания которых состоял в основном из очищенного риса. Проявление недостаточности тиамина можно наблюдать до сих пор у бедных людей в тех странах, где основу питания населения составляет полированный рис — в шлифованном зерне, в отличие от неочищенного, нет этого витамина. Последняя эпидемия бери-бери была на Филиппинах в 1953 г. (погибло 100 000 человек).

Болезнь имеет две формы: сухую (нервно-паралитическую) и отечную (сердечную). Причем в обоих случаях поражаются и сердечно-сосудистая и нервная системы, но в разной степени.

В настоящее время классической бери-бери, по-видимому, уже нет, однако явления умеренного гиповитаминоза отмечаются часто. К основным симптомам недостаточности тиамина относятся: физическая слабость, снижение аппетита (витамин В1 необходим для стимуляции желудочной секреции), стойкие запоры; расстройство функции нервной системы (онемение пальцев, чувство «ползания мурашек», утрата периферических рефлексов, боль по ходу нервов); нарушения психической деятельности (раздражительность, забывчивость, страх, иногда галлюцинации, снижение интеллекта). Позже развивается глубокое поражение нервной системы, характеризующееся потерей чувствительности конечностей, развитием параличей, атрофией мышц в результате нарушения их иннервации. При отечной форме, наряду с явлениями полиневрита, отмечаются тахикардия и одышка даже при незначительных нагрузках. Из-за слабости сердечной мышцы развиваются отеки. Особенно часто проявления тиаминовой недостаточности наблюдаются у хронических алкоголиков вследствие их склонности больше пить, чем есть. Синдром Вернике, развивающийся у этих лиц, характеризуется нарушением координации движений, зрительной функции, спутанностью сознания.

Особая чувствительность нервной ткани к недостатку тиамина объясняется тем, что коферментная форма этого витамина абсолютно необходима нервным клеткам для усвоения глюкозы, которая является для них почти единственным источником энергии (большинство других клеток организма может использовать иные энергетические вещества, например жирные кислоты). Кстати, питание преимущественно углеводной пищей (белый хлеб, сладости) приводит к повышенной потребности в тиамине и, следовательно, развитию вторичной тиаминовой недостаточности.

Врожденные нарушения обмена тиамина

Синдром Wernicke — Korsakoff. В основе этого синдрома, сопровож­дающегося потерей памяти и частичным параличом, лежит изменение свойств фермента транскетолазы, у которой уменьшается сродство к ТПФ. Гены других ТПФ-зависимых ферментов не затрагиваются. Заболевание проявляется, если уровень потребляемого ТПФ снижается ниже значений, необходимых для насыщения транскетолазы. Синдром часто встречается у хронических алкоголиков при недостаточном потреблении ими витаминов.

Перемежающаяся атаксия. Заболевание обусловлено врожденным дефектом пируватдегидрогеназы.

Тиаминзависимая форма болезни — «моча с запахом кленового сиро­па». При этой патологии отмечается дефект окислительного декарбок­силирования разветвленных кетокислот. В крови и моче резко увеличивается содержание разветвленных кетокислот (отсюда — специфический запах мочи) и их субстратов — аминокислот валина, изолейцина и лейцина. Клиническая симптоматика схожа с терминальной стадией В1-недостаточности.

Подострая некротизирующая энцефалопатия. При этом заболевании нарушается образование ТТФ в мозге. Энцефалопатия проявляется в потере аппетита, рвоте, затруднении сосания. Младенцы теряют способность держать головку, у них отмечаются многочисленные неврологические расстройства. Болезнь заканчивается без лечения летально в течение первых лет жизни.

Тиаминзависимая мегалобластическая анемия. Механизм участия тиамина в кроветворении до конца не выяснен.

Гипервитаминоз не описан. Избыток принятого витамина быстро выводится с мочой, но у некоторых лиц имеется повышенная чув­ствительность к парентеральному введению препаратов тиамина.

Оценка обеспеченности организма тиамином. С этой целью обычно определяют содержание витамина и/или его коферментов в эритроцитах крови. Поскольку при недостатке витамина В1 нарушается окислительное декарбоксилирование кетокислот, увеличение содержания в крови и моче пировиноградной и а-кетоглутаровой кислот будет свидетельствовать о недостатке тиамина в организме. Однако следует иметь в виду, что накопление пирувата отмечается не только при гиповитаминозе, но и при гипоксии и других патологических состояниях.

Наилучшим способом судить о степени обеспеченности организма витамином В1 является определение активности тиаминзависимых ферментов. Однако активность пируват - и а-кетоглутаратдегидогеназ снижается только при глубоком гиповитаминозе, поскольку их апофермент прочно связывает ТПФ. Транскетолаза связывает ТПФ слабее и активность ее в эритроцитах начинает снижаться уже на ранних стадиях гиповитаминоза В1. Если к образцу крови добавить ТПФ, то величина возрастания активности транскетолазы (так называемый ТПФ-эффект) позволит судить о степени недостаточности тиамина.

Суточная потребность. Пищевые источники. Довольно много витамина В1 содержится в пшеничном хлебе из муки грубого помола, в оболочке семян хлебных злаков, в сое, фасоли, горохе. Много его в дрожжах, меньше — в картофеле, моркови, капусте. Из продуктов животного происхождения наиболее богаты тиамином печень, нежирная свинина, почки, мозг, яичный желток. В настоящее время дефицит витамина В1 становится одной из проблем питания, так как из-за высокого потребления сахара и кондитерских изделий, а также белого хлеба и шлифованного риса существенно увеличивается расход этого витамина в организме. Использовать дрожжи в качестве источника витамина не рекомендуется из-за высокого содержания в них пуринов, что может приводить к возникновению обменного артрита (подагры).

Суточная потребность в тиамине — 1,1-1,5 мг.

ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ

Витамин В1

Витамин В1 (тиамин, антиневритный) состоит из 2-х гетероциклических колец - пиримидина и тиазола.

Физико-химические свойства. Витамин В1 хорошо растворяется в воде, термостабилен, в кислой среде выдерживает нагревание до 140°С; в нейтраль­ной и щелочной среде устойчивость к нагреванию значительно снижается. При традиционном хлебопечении потери тиамина составляют 10-30%.

Метаболизм витамина В1. Поступивший с пищей тиамин всасывается в кровь в тонкой кишке путем простой диффузии. В печени, а также в других ор­ганах и тканях большая часть тиамина фосфорилируется с помощью фермента тиаминфосфокиназы до тиаминмонофосфата (ТМФ), тиаминдифосфата или тиаминпирофосфата (ТДФ или ТПФ, соответственно) и тиаминтрифосфата (ТТФ). При дефосфорилировании освобождающийся тиамин подвергается био­трансформации - деметилирование пиримидинового кольца и конъюгация с цистеином, образовавшиеся конъюгаты выводятся с мочой.

Биологическая роль. Свою коферментную функцию витамин В1 выпол­няет в форме тиаминпирофосфата (ТПФ), который часто называют кокарбокси - лазой. ТПФ является коферментом ключевых реакций углеводного обмена, не­которых реакций белкового и жирового обмена. В частности, ТПФ является одним из 5 коферментов а-кетоглутарадегидрогеназного и пируватдегидроге - назного комплексов, катализирующих превращение а-кетоглутарата в сукци - нил-КоА и пирувата в ацетил-КоА, соответственно. Это ключевые реакции об­щих путей катаболизма белков, жиров и углеводов, также они обеспечивают взаимосвязь белкового, углеводного и жирового обменов. ТПФ является ко - ферментом транскетолазы - одного из ферментов пентозофосфатного цикла.

Витамин В1 часто называют «витамином бодрости духа» вследствие его положительного влияния на нервную систему и умственные способности.

Клиническое применение витамина Bi. Витамин B1 применяется для лечения различных заболеваний, в частности полиневрита, неврозов, артери­альной гипертензии, атеросклероза и др. В форме ТПФ (кокарбоксилаза) при­меняется при патологических состояниях, связанных с нарушением углеводно­го обмена, почечной недостаточности, нарушениях коронарного кровообраще­ния. В стоматологии витамин B1 применяется при лечении активного кариеса, глоссалгии, парестезии слизистой оболочки рта, комплексной терапии заболе­ваний пародонта, при заболеваниях слизистой оболочки бактериального, меди­каментозного и грибкового характера.

С целью профилактики гиповитаминозов широких групп населения, ви­тамин В1 в комплексе с другими витаминами группы В (рибофлавином и нико­тиновой кислотой) используется для витаминизации хлебобулочных изделий.

Гиповитаминоз B1

Гиповитаминоз B1 - один из самых распространенных гиповитаминозов и относится к так называемым «болезням цивилизации».

Причины гиповитаминоза В1. Основными причинами недостаточной обеспеченности витамином В1 является однообразное питание очищенным ри­сом и хлебобулочными изделиями из муки тонкого помола, бедных тиамином, при одновременном увеличении потребления сахара и кондитерских изделий, увеличивающих легковсасываемую углеводную часть пищевого рациона, что приводит к повышению потребности организма в тиамине.

Также причиной гиповитаминоза В1 может быть повышенное употребле­ние в пищу продуктов, содержащих тиаминазу (инактивирует тиамин), напри­мер, сырой рыбы; размножение в желудочно-кишечном тракте патологической микрофлоры (Bacillus thiaminolyticus, Bacillus aneurmolyticus), продуцирующей тиаминазу.

У пожилых людей и у лиц, страдающих хроническим алкоголизмом, не­достаток витамина В1 может быть обусловлен общим снижением количества потребляемой пищи и уменьшением всасывания витамина в кишечнике. Прием лекарственных препаратов, обладающих свойствами антивитамина В1, напри­мер, прием пиритиамина сопровождается явлениями полиневрита, характерны­ми для гиповитаминоза В1.

Причиной клинических проявлений гиповитаминоза В1, развивающихся при достаточном поступлении тиамина в организм, могут быть генетически обусловленные дефекты обмена тиамина и ТПФ-зависимых ферментов: подо - страя некротизирующая энцефаломиелонатия, или болезнь Лея (нарушено об­разование в мозговой ткани ТТФ - тиаминтрифосфата); перемежающаяся атак­сия (при врожденном дефекте пируватдегидрогеназного комплекса); тиаминза - висимая мегалобластическая анемия и тиаминзависимая форма болезни «моча с запахом кленового сиропа» (дефект окислительного декарбоксилирования раз­ветвленных а-кетокислот).

Нарушения метаболизма при гиповитаминозе В1. При недостатке тиа­мина в организме снижается скорость ТПФ-зависимых реакций энергетическо­го, углеводного, жирового и белкового обменов, в крови и тканях накапливают­ся недоокисленные продукты, вследствие чего развивается ацидоз.

Снижается чувствительность клеток к инсулину. Снижается эффектив­ность транскетолазной реакции, что может привести к дефициту рибозо-5- фосфата, необходимого для синтеза нуклеотидов, используемых на синтез нук - леотидных коферментов, макроэргов (АТФ, ГТФ, УТФ и др.) и нуклеиновых кислот (РНК и ДНК).

Снижается образование восстановленного НАДФ, необходимого для раз­личных восстановительных реакций (биосинтез жирных кислот, холестерола и его производных, восстановление глутатиона и др.). Нарушается водный обмен,

что проявляется задержкой воды в организме и развитием отеков.

Клинические проявления гиповитаминоза В1 (болезнь Бери-бери).

Клинические признаки гиповитаминоза В1 у взрослого человека появля­ются если он в течение 5-6 дней получает половину необходимого количества витамина. Наиболее значительные изменения развиваются в пищеварительной, нервной и сердечно-сосудистой системах.

Нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта являются наиболее ранними проявлениями недостаточности витамина В1: потеря аппетита, ощу­щение тяжести и дискомфорта (жжение) в подложечной области, атония желу­дочно-кишечного тракта, снижение желудочной секреции, ахлоргидрия, диарея, тошнота, рвота, сильное исхудание.

Нарушения со стороны нервной системы проявляются поражениями пе­риферической и центральной нервной системы: головными болями, повышен­ной нервной возбудимостью, умственной и физической утомляемостью, посто­янной усталостью, бессонницей, беспокойством, нарушениями памяти, депрес­сией, плаксивостью, потливостью, гипотермией, парестезиями (зуд и покалы­вание в руках и ногах), зябкостью при комнатной температуре. Резко снижается кожная чувствительность (тактильная, температурная, болевая). Снижается мышечный тонус, развиваются периферические полиневриты, паралич и атро­фия мышц конечностей, утрачиваются коленный и лодыжечный рефлексы. Развивается энцефалопатический синдром Вернике-Корсакова, характеризую­щийся спутанностью сознания, дискоординацией движений (больные, точно в кандалах, с трудом передвигают ноги, в связи с этим появилось обозначение гиповитаминоза В1 как болезнь «бери-бери» - «ножные оковы»), офтальмопле­гией. В тяжелых случаях развивается паралич ног, рук, зрительного нерва, гор­тани и наступает смерть.

Патологические изменения в сердечно-сосудистой системе проявляются тахикардией, артериальной гипотензией, одышкой даже при незначительном физическом напряжении, экстрасистолами, болями в области сердца, дилатаци - ей сердца с преимущественным расширением правых отделов, изменениями

ЭКГ, отражающими нарушения проводимости. В тяжелых случаях развивается сильная сердечная слабость, отеки и все заканчивается смертельным исходом.

Высокие дозы витамина B1 при длительном применении приводят к на­рушению функций печени и почек. Побочным эффектом являются кожный зуд и крапивница.

Суточная потребность в витамине B1 1-3 мг (0,6 мг на 1000 ккал при обычном питании или 1 мг на 1000 ккал при безжировой диете).

Повышается потребность в витамине В1 при тяжелых физических на­грузках (спортсмены), стрессах, избытке углеводов в пище, особенно у детей, белковом голодании, потреблении в больших количествах сырой рыбы (карпа, плотвы, леща, тюльки) и кофе, содержащих тиаминазу, в условиях жаркого или холодного климата, беременности, особенно при осложняющих ее токсикозах, лактации, гиперфункции щитовидной железы, заболеваниях желудка и кишеч­ника, особенно сопровождающихся диареей, нарушениями всасывания тиами­на, диабете, подагре, алкоголизме, курении, различных инфекциях, как острых (грипп, дизентерия, дифтерия, гепатит и др.), так и хронических (туберкулез, лепра), интоксикации сульфаниламидами и антибиотиками, отравлении тетра - этилсвинцом, ртутью, таллием, мышьяком, сероуглеродом, метиловым спир­том, у пожилых людей.

Практически каждый современный человек нуждается в дополнительном приеме препаратов витамина B1.

Потребление белков высокой биологической ценности и жиров несколь­ко снижает потребность в витамине В1.

Пищевые источники витамина B1: хлеб из муки грубого помола или из витаминизированной муки, бобовые, гречневая, овсяная и пшенная крупы, оре­хи, печень, нежирная свинина, телятина, дрожжи. В молоке и молочных про­дуктах витамина B1 содержится мало.

ВИТАМИН  В1  (ТИАМИН)

Тиамин состоит  из  двух  циклических систем,  пиримидинового кольца и тиазолового кольца, связанных метиленовой группой. Активной формой витамина является тиаминдифосфат, иначе тиаминпирофасфат, который в качестве кофактора ферментов участвует в переносе активных альдегидных групп при окислительном декарбоксилировании  2-кето-кислот и в транскетолазных реакциях гексозомонофосфатного пути.

Недостаток витамина приводит к заболеванию «бери–бери», симптомами которого являются неврологические растройства, сердечная недостаточность и мышечная атрофия.

Лабораторная работа № 1

Качественные реакции на витамин  В1

Материалы, посуда, реактивы:тиаминбромид, в порошке;

5% раствор же­лезосинеродистого  калия  (феррицианид  калия - КзFe(CN)6),;

10%  раствор гидроксида натрия;

бутиловый или изоамиловый спирт;

0,01% раствору тиамина, подкисленный соляной кислотой до рН 3-4 (или 0,01% раствор тиаминхлорида);

диазореактив (основной раствор) готовят растворением 0,9 г сульфаниловой кислоты в 9 мл концентрированной НС1 с последующим разбавлением дистиллиро­ванной водой до 100 мл (хранят в склянке из темного стекла);

перед определением готовят рабочий раствор: в мерную колбу на 50 мл, помещенную в сосуд со льдом, вносят 1,5 мл основного раствора, добавляют 1,5 мл свежеприготовленного 5% раствора нитрита натрия NaNО2, через 5 мин добавляют при помешивании еще 6 мл раствора нитрита натрия и доводят дистиллированной водой, ох­лажденной на льду, до метки; реактив готов через 15 мин (может хра­ниться в холодильнике не более одних суток);

карбонатно-щелочной раствор: перед употреблением смешивают равные объемы 4% раствора гидроксида натрия и 5,76% раствора карбоната натрия;

пробирки; пипетки.

А) Тиохромная реакция.

Тиамин в щелочной среде окисляется железосинеродистым калием в тиохром, обладающий го­лубой флуоресценцией в ультрафиолетовом свете:

Немного порошка тиаминбромида (около 10 мг) растворяют в 5 мл воды, прибавляют 1 мл 5% раствора железосинеродистого калия, 1 мл 10% раствора гидроксида натрия, 5 мл бутилового (или изоамилового) спирта. Пробирку (или стаканчик) хорошо встряхи­вают и оставляют на несколько минут. Верхний, спирто­вой слой осторожно сливают в пробирку из нефлуоресцирующего стекла и рассматривают в лучах ртутно-кварцевой лампы (в темном помещении). Хорошо заметна голубая или синяя флуоресценция.

Б) Диазореакция на витамин B1.

Раствор тиамина при добавлении к нему диазореактива и щелочи окрашивается в оранжевый или красный цвет вследствие образование сложного соединения тиами­на с диазобензосульфокислотой.

К 2 мл карбонатно-щелочного раствора добавляют 1 мл диазореактива и 1-2 мг порошка тиаминбромида (на кончике скальпеля). Вначале появляется желтое окрашивание, которое через 1-2 мин. переходит в розо­вое или красное.