Микробиологические исследования окружающей среды (стр. 4 )

Для количественного учета результатов посевов путем подсчета выросших колоний (КОЕ) отбирают те чашки, на которых выросло от 5-ти до

50-ти колоний дрожжей и (или) от 5-ти до 50-ти колоний плесневых грибов.

Метод выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes

Метод основан на высеве определенного количества продукта в жидкую селективную питательную среду (с предварительным обогащением, последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и культивировании посевов при оптимальных условиях. Принадлежность выделенных колоний к L. monocytogenes определяют по биохимическим и антигенным свойствам.

Отбор и подготовка проб для анализа

Масса или объем навески должны составлять 25,0 ± 0,1 г (см3) для мясных продуктов и 50,0–100,0 г (см3) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания.

Методика проведения анализа

Соотношение между количеством продукта детского, лечебного питания и питательной средой должно составлять 1:9, поэтому навеску исследуемого пищевого продукта массой 25,0 ± 0,1 г или объемом 25,0 ± 0,1 см3 вносят в 225,0 см3 (225,0 мл) жидкой среды для предварительного обогащения.

Посевы инкубируют при температуре 30–31 °С в течение 24–26 часов, затем навеску засевают на бульон Фразера, содержащий эскулин, в соотношении 1:9.

При росте листерий на бульоне Фразера отмечается почернение среды, в то время как на питательной среде без эскулина почернения не происходит.

После инкубирования продукта на бульоне Фразера содержимое среды независимо от наличия в нем изменений в количестве 1,0 см3 пересевают в 10,0 см3 одной из сред обогащения и вновь посевы инкубируют при температуре 37–38 °С в течение 48 часов.

После этого при отсутствии роста характерных для листерий колоний на селективно-диагностических средах дают заключение об отсутствии L. monocytogenes в исследуемой пробе продукта.

При обнаружении роста листерий, сопровождающегося почернением колоний и среды, по комплексу других биологических свойств определяют принадлежность колоний к бактериям данного рода. С этой целью, используя стандартные методики, определяют:

— отношение к окраске по Граму;

— наличие или отсутствие капсул и спор;

— подвижность бактерий при температуре 22–23 °С и 37–38 °С;

— каталазную активность;

— нитратредуцирующие свойства.

К бактериям рода L. monocytogenes выделенные микроорганизмы могут быть отнесены, если они — грамположительные короткие тонкие палочки, не образующие спор и капсул, подвижны при температуре 22–23 °С, каталазопозитивны, не восстанавливают нитраты в нитриты.

Дальнейшую идентификацию до вида L. monocytogenes проводят общепринятыми методами, используя постановку реакции агглютинации по идентификации с поливалентной листериозной агглютинирующей сывороткой.

Положительным результат анализа продукта на содержание L. monocytogenes считается, если из среды накопления выделены грамположительные короткие тонкие неспорообразующие палочки, капсулы не имеют, подвижны при температуре 22–23 °С, неподвижны при 37–38 °С, каталазоположительны, гидролизующие эскулин, ферментируюшие с образованием кислоты рамнозу и мальтозу, не сбраживающие маннит и ксилозу, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию агглютинации по идентификации с соответствующей агглютинирующей сывороткой.

Определение бактерий из рода Proteus

Сущность метода заключается в определении у выделенной культуры морфологических свойств, характера роста, способности гидролизовать мочевину и образовывать сероводород.

Методика проведения анализа

0,5 мл анализируемой взвеси бактерий (из предварительно выделенной чистой культуры) вносят в конденсационную воду свежескошенного мясопептонного агара, разлитого в широкие пробирки, не касаясь поверхности среды (метод Шукевича).

Через 18–24 часа инкубации при температуре 37 °С основное внимание уделяют возможному образованию ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком на поверхности скошенного агара и подъему культуры из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды.

При наличии такого роста, характерного для протеев, культуру бактерий микроскопируют, изучают ее подвижность в препарате «висячая капля» и биохимические свойства стандартными методами.

Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, дающих ползучий рост вследствие высокой подвижности, ферментирующих глюкозу и мочевину и не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий рода Proteus.

Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Метод основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при 30 °С в течение 72 часов.

Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний.

Из каждой пробы делают высев на 2–3 чашки, причем каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1,0 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой в залито 10,0–15,0 см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40–45 °С питательной среды для определения общего количества бактерий. Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1,0 см3 и 0,1 см3.

Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в термостат при температуре 30 °С на 72 часа.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, и пользуясь лупой с увеличением в 4–10 раз.

При большом числе колоний дно чашки делят на 4 и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на 2–3-х секторах, находят среднее арифметическое и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке и вычисляют общее количество бактерий в 1,0 см3 или 1,0 г продукта по следующей справке:

X = n × 10m, где n — число колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m — число десятикратных разведений.

Молоко и молочные продукты

При исследовании санитарно-экологического качества молока и продуктов из него пользуются методами микробиологического анализа (по ГОСТ 9225–84), а также методами определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий (по ГОСТ 25102–90).

Определение спор мезофильных анаэробных бактерий

Для определения общего количества спор мезофилыиых анаэробных бактерий в молоке и сырах производят посев 1,0 см3 исследуемого образца (для молока — из нулевого, первого и второго, а для сыров — первого и второго разведения) в пробирку с 10 ± 2,0 см3 специальной питательной среды, предварительно выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 минут и охлажденной.

При этом каждый образец выбранных разведений исследуемого молока и сыра засевают в 2 пробирки с питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания и заливая сразу после посева пробирки слоем предварительно расплавленного и охлажденного до 45 °С водного агара, высота которого должна быть не менее 20,0 ± 5,0 мм.

Посевы инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 72 часов.

Наличие спор мезофильных анаэробных бактерий в засеянных объемах исследуемого образца молока или сыр определяют по появлению разрывов агарового столбика, образуемых в результате газообразования при росте этих бактерий.

Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе сыра определяют по числу пробирок, в которых они дали рост с посевом 0,1 см3 и 0,01 см3 (Приложение, табл. 13).

Методы анализа качества продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов (по СанПиН 42–123–4940–88)

Определение Еscherichia соli в продуктах детского питания

Бактерии вида Е. соli, входящие в группу колиформных бактерий, являющиеся индикатором относительно свежего фекального загрязнения, представляют собой грамотрицательные, неспорообразующие палочки, не утилизирующие цитрат, способные расти и ферментировать лактозу при температуре выше температуры тела (от 44 до 45,5 °С).

Метод основан на выявлении способности кишечной палочки фементировать лаквiозу с образованием кислоты и газа при температуре 44 °С от 24 до 48 часов. Идентификацию Е. coli проводят по следующим таксономическим признакам: образование индола, положительная реакция с красным метилом, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра и отсутствие способности утилизировать цитрат.

Методика проведения анализа с предварительной инкубацией

Асептически взвешивают 10,0 г сухого детского продукта «Детолакт», растворяют в колбе в 90,0 см3 разбавленного фосфатного буфера; рН доводят до 7,0, для чего используют пастеризованный 1н раствор гидроокиси натрия или 1н раствор соляной кислоты, проверяя рН индикаторной бумажкой.

Колбу помещают в термостат и выдерживают при температуре 37 °С в течение 24 часов.

1,0 см3 смеси из этой колбы засевают в пробирку или колбу с 9,0 см3 среды Кесслера с лактозой и поплавком и инкубируют при температуре 44 °С в течение 24 часов.

При отсутствии газа, помутнения, изменения цвета среды в посевах продуктов, подвергавшихся предварительной инкубации, результат анализа считают отрицательным и дают заключение об отсутствии в нем Е. coli, т. е. соответствии продукта нормативу по этому показателю.

Методика проведения анализа без предварительной инкубации

Навеску продукта 10,0 г (см3) помещают в колбу с 90,о см3 среды Кесслера с лактозой и поплавком и инкубируют при 44 °С 24 часа.

При отсутствии признаков роста (газообразование и помутнение среды) посевы инкубируют еще 24 часа.

При отсутствии газа и других признаков роста в посевах дают заключение об отсутствии в продукте Е. coli и соответствии нормативу по этому показателю.

Пробирки (колбы), в которых обнаружен газ или другие признаки роста, подвергают дальнейшему изучению, для чего производят посев штрихом или рассевом на поверхность чашки Петри с подсушенной средой Эндо или Левина так, чтобы получить изолированные колонии. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

При просмотре посевов необходимо учитывать, что эшерихии на среде Эндо дают красные с металлическим блеском или без него розовые колонии; на агаре Левина – черные, темно-коричневые с темным центром, с металлическим блеском или без него.

Если из окрашенных колоний при микроскопии мазков окрашенных по Граму и на наличие спор, обнаруживаются грамотрицательные неспорообразующие палочки, то все типичные колонии подвергаются идентификации по ИМАЦ-тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра, утилизация цитрата).

При учете результатов в первую очередь обращают внимание на наличие роста и/или изменение цвета среды Симмонса, содержащей цитрат, с зеленого на синий или желтый, что характерно для цитрат-положительных культур. Для цитрат-отрицательных разновидностей бактерий характерно отсутствие роста и изменения цвета среды.

При выделении из продукта грамотрицательных неспорообразующих палочек, продуцирующих газ на лактозе при температуре 44 °С, образующих или не образующих индол, дающих положительную реакцию с метиловым красным, отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и не растущих на среде Симмонса (Козера), считают, что в 10,0 г продукта содержится E. coli.

Продукт в данном случае бракуется. При обнаружении в 10,0 г продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии колиморфных бактерий в 1,0 г продукт браковке не подлежит.

Определение сальмонелл (бактерий рода Salmonella) в пищевых продуктах

Метод основан на использовании сред обогащения для увеличения роста сальмонелл, их выделении на специальных агаровых средах, идентификации с использованием биохимических и серологических методов.

Для посева используют то количество продукта, в котором регламентируется отсутствие бактерий рода Salmonella. Перед посевом проводят инкубацию продукта в фосфатном буферном растворе.

Компоненты детских сухих молочных продуктов засевают без предварительной инкубации, непосредственно в колбу со средой для селективного обогащения.

Посев с предварительной инкубацией

Продукт взвешивают в стерильных условиях в стакане и затем для предварительного обогащения навеску асептически переносят в колбу разбавленным фосфатным буфером. Соотношение массы продукта буферного раствора 1:10, рН доводят до 7,0 ± 0,2 1н раствором гидроокиси натрия, перемешивают и встряхивают.

К приготовленной таким образом взвеси продукта добавляют 0,1 %-ный водный раствор бриллиантового зеленого в количестве 2 % к объему (т. е. 20,0 см3 раствора красителя к 1000,0 см3 взвеси продукта), перемешивают и выдерживают в термостате при температуре 37 °С от 18 до 24 часов.

На следующий день 1,0 см3 выдержанной в термостате смеси переносят пробирки с 10,0 см3 магниевой среды или среды Мюллера и инкубируют при температуре 37 °С в течение 18–24 часов.

Прямой посев в среды для селективного обогащения

Асептически сделанные навески сухих компонентов продукта засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение продукта и среды 1:9.

Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиента при соотношении продукта и среды 1:1.

В обоих случаях колбы с посевами инкубируют в течение 18–24 часов при 37 °С, после чего производят высев на поверхность чашек с подсушенными дифференциально-диагностическими средами — Плоскирева и висмут-сульфит агара. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С в течение 24–48 часов, причем просмотр посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 часов после инкубации.

При наличии смешанного роста необходимо сделать повторный пересев на питательный агар для выделения чистых культур и получения изолированных колоний.

Типичные колонии сальмонелл бывают:

— на среде Плоскирева — бесцаетные, прозрачные, плоские;

— на висмут-сульфитном агаре — черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с темным ободком, при этом наблюдается окрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При отсутствии типичных колоний сальмонелл на каждой из сред результат анализа считают «отрицательным», т. е. в исследуемой массе продукта сальмонелл нет.

При наличии на чашках Петри типичных для сальмонелл колоний или колоний, подозрительных на сальмонеллы, производят их дальнейшее изучение.

Для этого выбирают хорошо изолированную колонию и засевают на пробирки с трехсахарным агаром с мочевиной или средой Клиглера и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

Идентификацкю выделенных культур проводят, соответственно, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины:

— покраснение или пожелтение скошенной части столбика трехсахарной среды (при посеве уколом) говорит об образовании кислоты в результате ферментации лактозы или сахарозы;

— покраснение столбика трехсахарной среды указывает на расщепление глюкозы;

— бледно-розовый цвет столбика трехсахарной среды указывает на расщепление мочевины;

— об образовании сероводорода судят по почернению в столбике трехсахарной среды.

Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, то они не принадлежат к бактериям рода Salmonella, поэтому дальнейшему изучению подвергаются культуры, не ферментирующие лактозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа).

Прямой посев в среды для селективного обогащения

Асептически сделанные навески сухих компонентов продукта засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение продукта и среды 1:9.

Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиента при соотношении продукта и среды 1:1.

В обоих случаях колбы с посевами инкубируют в течение 18–24 часов при 37 °С, после чего производят высев на поверхность чашек с подсушенными дифференциально-диагностическими средами — Плоскирева и висмут-сульфит агара. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С в течение 24–48 часов, причем просмотр посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 часов после инкубации.

При наличии смешанного роста необходимо сделать повторный пересев на питательный агар для выделения чистых культур и получения изолированных колоний.

Типичные колонии сальмонелл:

— на среде Плоскирева — бесцветные, прозрачные, плоские;

— на висмут-сульфитном агаре — черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с темным ободком, при этом наблюдается окрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При отсутствии типичных колоний сальмонелл каждой из сред результат анализа считают «отрицательным», т. е. в исследуемой массе продукта сальмонелл нет.

При наличии на чашках Петри типичных для сальмонелл колоний или колоний, подозрительных па сальмонелл, производят их дальнейшее изучение.

Для этого выбирают хорошо изолированную колонию и засевают на пробирки с трехсахарным агаром с мочевиной или средой Клиглера и инкубируют при 37 С в течение 24 часов.

Идентификацию выделенных культур проводят, соответственно, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины:

— покраснение или пожелтение скошенной части столбика трехсахарной среды (при посеве уколом) говорит об образовании кислоты в результате ферментации лактозы или сахарозы;

— покраснение столбика трехсахарной среды указывает на расщепление глюкозы;

— бледно-розовый цвет столбика трехсахарной среды указывает на расщепление мочевины;

— об образовании сероводорода судят по почернению в столбике трехсахарной среды.

Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, то они не принадлежат к бактериям сальмонелл поэтому дальнейшему изучению подвергаются культуры, не ферментирующие лактозу и нё расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа).

Культуры, ферментирующие глюкозу без образования газа, подозрительных как брюшнотифозные сальмонеллы или дизентерийные бактерии.

Культуры, ферментирующие глюкозу с образованием газа, т. е. дающие в среде пузырьки, и продуцирующие сероводород, могут принадлежать к роду сальмонелл.

Если во всех пробирках отсутствует характерная для сальмонелл реакция, результат считают отрицательным и дают заключение об отсутствии в исследуемой массе продукта бактерий рода сальмонелл.

Если обе пробирки покажут типичную для сальмонелл реакцию, а выделенный штамм дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, то в этом случае проводят серологическую идентификацию с помощью реакции агглютинации по идентификации с сальмонеллезными О-сыворотками. Если реакция агглютинации по идентификации отрицательная (агглютинации не наблюдается в течение 30–60 секунд), то конечный результат анализа записывают как отрицательный.

При выделении культур грамотрицательных палочек, ферментирующих глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующих лактозу и сахарозу, образующих или не образующих сероводород, дающих отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и положительную реакцию агглютинации по идентификации с соответстнующими сальмонеллезными О-сыворотками, считают, что в исследуемой навеске продукта присутствуют бактерии рода сальмонелл, и продукт к реализации не допускается.

Определение коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus) (по СанПиН 42–123–4940–88)

Метод основан на способности микроскопических организмов рода Staphylococcus расти в средах с повышенным содержанием хлорида натрия (6,5 %).

При этом наибольшее экологическое значение имеет обнаружение среди всех представителей данного рода и вида коагулазоположительных S. aureus — способных коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика.

Методика проведения анализа

Навеска продукта должна составлять:

— 10,0 г — без предварительной термической обработки;

— 1,0 г — с предварительной термической обработкой.

Сухие молочные продукты типа «Детолакт», «Новолакт ММ», «Новолакт-1», восстанавливаемые перед употреблением при 37 °С и 70 °С, перед посевом подвергаются разведению в фосфатном буферном растворе.

В стерильных условиях взвешивают 10,0 г или, соответственно, 1,0 г продукта и помещают в колбы с 90,0 см3 или, соответственно, 9,0 см3 разбавленного фосфатного буфера, тщательно перемешивают.

Полученную смесь инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов, затем 1,0 см3 этой смеси переносят в пробирку с соленым бульоном (6,5 % натрия хлорида) и снова инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

Жидкие, пастообразующие и другие продукты, не подвергающиеся предварительной инкубации, в количестве 1,0 г или 10,0 г засевают в пробирки или колбы с соленым бульоном при соотношении продукта и среды 1:10. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов.

В обоих случаях для выделения чистой культуры стафилококков делают пересев петлей из соленого бульона на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер или желточно-солевой агар (ЖСА) и снова инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов.

Учет роста колоний:

— на среде Байрд-Паркер S. aureus растет в виде черных, блестящих, выпуклых колоний. При этом штаммы золотистого стафилококка, выделенные из пищевых продуктов и штаммы, продуцирующие энтеротоксин, на этой среде часто дают просветление через 24 часа инкубации при 37 °С.

— на желточно-солевом агаре (ЖСА) колонии стафилококка имеют форму выпуклых дисков белого, желтого, кремового, лимонного цвета с ровным краем, окруженные зоной лецитиназной активности.

Из подозрительных на стафилококк колоний в любом случае готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

При обнаружении грамположительных кокков, расположенных в виде скоплений, делают пересев на скошенный агар (МПА с 0,1 % глюкозой) для накопления чистой культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

Выделенную чистую культуру пересевают на среду Гисса с маннитом или мальтозой, разлитую высоким столбиком (посев производят уколом) и снова инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или мальтозой наблюдается ферментация или окисление углевода, сопровождающиеся изменением цвета среды.

Выделенную чистую культуру также обязательно исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы для проведения реакции в стерильную пробирку с 0,5–1,0 см3 цитратной плазмы крови кролика вносят одну петлю суточной агаровой культуры бактерий. Еще одну пробирку с плазмой крови оставляют незасеянной для контроля. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Результат реакции при этом учитывают через 2, 4, 6 и 24 часа.

При учете реакции плазмокоагуляции возможно 2 варианта:

— реакция плазмокоагуляции считается положительной при образовании даже небольшого сгустка плазмы через 24 часа культивирования, соответственно, исследуемую культуру относят к коагулазоположительным, что в свою очередь свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в 10,0 г или, соответственно, 1,0 г (см3) продукта.

— реакция плазмокоагуляции считается отрицательной, если свертывание плазмы не происходит через 24 часа культивирования, исследуемую культуру относят к коагулазоотрицательным.

Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительного стафилококка в засеянной массе.

При значительном росте коагулазоотрицательных стафилококков в посевах детских сухих молочных смесей необходимо обратить внимание на соблюдение санитарно-экологических норм их изготовления, т. к. у детей грудного возраста некоторые коагулазоотрицательные стафилококки способны вызывать острые энтериты.

Определение бактерий Васillиs cereus

В. cereus — аэробные спорообразующие грамположительные палочки, некоторые штаммы которых способны продуцировать энтеротоксин.

В продуктах, выработанных с соблюдением технологических правил, при посеве 0,01 г рост В. cereus должен отсутствовать, что соответствует показателю по этому микроорганизму — менее 10 клеток на грамм.

При несоответствии нормативу только по В. cereus в сухих молочных продуктах типа «Детолакт» (в отдельных случаях от 100 до 200 КОЕ/г) партия однократно не задерживается для реализации, В таких случаях проводят исследование на наличие В. cereus в компонентах растительного и животного происхождения. В случае обнаружения значительного количества бактерий дают рекомендации о возможности использования их в производстве.

Метод основан на выявлении и количественном подсчете колоний бактерий вида В. cereus, относящихся к спорообразующим бациллам, при росте их на специальных плотных питательных средах.

Методика проведения анализа

Производят посев по 0,1 см3 (0,01 г) и по 0,2 см3 (0,02 г) сухих молочных продуктов из разведения 1:10 на поверхность хорошо подсушенной плотной специальной питательной среды доiована, разлитой в чашки Петри.

Посевы инкубируют при 30 °С в течение 24–96 часов.

При отсутствии роста на обеих чашках дают заключение о соответствии детской сухой молочной смеси нормативу по этому показателю.

При обнаружении роста на среде Донована изучают выросшие колонии, учитывал при этом, что В. cereus на среде Донована образуют крупные белые распластанные колонии с изрезанными краями, окруженные зоной глубокого белого матового коагулята или зоной просветления результат проявления лецитиназной активности.

Из изучаемых колоний делают мазки, окрашивают по Граму и на наличие спор, затем микроскопируют, учитывая, что В. cereus грамположительные спорообразующие палочки.

Для накопления чистых культур 3–5 колоний пересевают на скошенный агар с последующей инкубацией при 30 °С в течение 24–48 часов.

У выделенных чистых культур методом «висячей капли» определяют подвижность. Кроме этого, эти культуры засевают: на кровяной агар; на среду с маннитом; на среду Кларка для постановки реакции Фогес-Проскауэра (в пробирки).

Посевы инкубируют при 30 °С в течение 24–48 часов.

Характерными признаками для бактерий вида В. cereus являются: наличие подвижности; положительная проба на лецитиназу; гемолитическая активность (образование зон просветления вокруг колоний) на кровяном агаре; отсутствие способности ферментировать маннит; положительная реакция Фогес-Проскауэра.

Подсчет обнаруженных в продукте бактерий вида В. cereus проводят путем умножения количества типичных выросших на среде Донована колоний на соответствующее разведение, затем пересчитывают в расчете на 1,0 г или 1,0 см3 исследуемого продукта.

Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах

(по МУК 4.2.026–95)

Допустимое значение антибиотиков для продуктов не должно превышать для тетрациклина 0,01 ЕД, пенициллина — 0,01 ЕД, стрептомицина 0,5 ЕД на 1,0 г (мл) продукта.

Метод качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах, основан на подавлении антибиотиками дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, то клетки тест-культур теряют способность восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях, поскольку метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора.

Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения ответа через 4–5 часов, относительной простоте и значительной экономии питательной среды.

Методика проведения анализа состоит из нескольких этапов:

1. Подготовка проб к исследованию при качественном и. количественном определении.

2. Получение и хранение взвеси из клеток тест-культур.

3. Определение рабочей дозы» тест-культуры.

4. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе.

5. Качественное определение антибиотиков.

Подготовка проб к исследованию при качественном определении

Молоко (по ГОСТ 13928–84).

Сырое молоко желательно подвергать исследованию в день отбора, как можно быстрее после получения; до начала анализа сохранять в холодильнике при температуре 4 ± 1 °С. Пробу в объеме не менее 10,0 см3 переносят в пробирку.

Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока).

Непосредственно перед исследованием продукты подвергаются восстановлению в кипяченой воде при температуре не выше 45 ± 1 °С в соответствии с указаниями на этикетке. Образцы тщательно перемешивают, они не должны содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробы для анализа объемом не менее 10,0 см3.

Мясо и субпродукты

Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и т. д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают при помощи мясорубки или гомогенизатора, помещают полученный фарш в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевой сок в объеме не менее 10,0 см3 переносят в пробирку.

Термическая обработка проб пищевых продуктов

Перед проведением исследования пробирки с отобранными пробами помещают в водяную баню с температурой 60 ± 1 °С. Параллельно с испытуемыми образцами в водяную баню помещают пробирки с аналогичным продуктом и термометром. Время прогревания — 30 минут — отмечают от момента достижения температуры внутри пробирки.

Подготовка проб к исследованию при количественном определении.

Молоко, молочные продукты, яйца

Для определения концентрации антибиотика в молоке, жидких молочных продуктах, кроме кисломолочных, яйцах, пробы, подготовленные к исследованию в количестве 10,0 мл или 10,0 г (смешанного содержимого каждого яйца) вносят в колбы емкостью 50,0 мл и добавляют равное количество (10,0 мл) буферного раствора соответственно определяемому антибиотику: тетрапиклин цитратно-солянокислый (рН 5,8–6,0), стрептомицин – 0,066 М фосфатный буфер (рН 7,8–8,0), пенициллин — 0,066 М фосфатный буфер (рН 6,8–7,0). Таким образом, получают пробы для исследования, разведенные в два раза.

Мясо и мясные продукты

Навески по 10,0 г мышечной ткани, почек, печени, легкого и т. д., вырезанные из средней части образца, измельчают ножницами или микроразмельчителем тканей с последующим растиранием в ступке со стерильным кварцевым песком. Затем в ступку добавляют 10,0 мл соответствующего буфера, тщательно перемешивают и переносят в центрифужные пробирки.

Экстракцию антибиотика проводят в течение 90 минут в термостате при 37 ± 1 °С. Затем пробы прогревают на водяной бане при 65 ± 1 °С в течение 20 минут. Из надосадочной жидкости, являющейся первым разведением 1:2, берут 1,0 мл и прибавляют 1,0 мл соответствующего буфера, получают второе разведение 1:4 и т. д. Концентрацию антибиотика определяют в надосадочной жидкости, полученной от каждого образца мяса и мясных продуктов.

Получение и хранение взвеси клеток тест-культур

Тест-культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Ваcillиs subtilis вар. 6633, В. subtilis вар. L2, В. micoides 537, Мiсrococcus luteum АТСС 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.

Для определения тетрациклина предпочтительно пользоваться штаммом В. subtilis вар. L2, а для пенициллина и стрептомицина – всеми остальными.

Музейные штаммы вегетативных форм тест-культур хранят в столбике полужидкого (0,4 %) питательного агара.

Вначале тест-культуру рассевают на чашки с 2 % МПА для получения отдельных колоний и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 20–24 часов. После этого для накопления чистой культуры отсевают в пробирки с 2 % скошенным МПА и вновь инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 20–24 часов.

Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков. Полученную взвесь хранят в холодильнике при температуре 4 ± 1 °С не более 7 дней.

По дегидрогеназной активности жизнеспособных клеток тест-культуры в смыве определяют «рабочую дозу» тест-культуры, т. е. наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время (1 час) в термостате при температуре 37 °С.

Количественное определение концентрации антибиотика и расчет активности

При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах параллельно ставят контрольный ряд с известным содержанием антибиотика в пробирках. для этого навеску стандарта антибиотика 1,0 г растворяют в 1 1,0 мл соответствующего буфера, получал, таким образом, основной раствор стандарта 1000,0 мкг/мл. Затем основной раствор десятикратно разводят до получения 100,0 мкг/мл и 10 мкг/мл. Далее концентрации, с которых начинается титрование стандарта в контрольном ряду, разводят соответствующими буферными растворами.

Титрование стандарта антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме 0,5мл МПБ. Последняя пробирка в контрольном ряду не содержит антибиотика и служит контролем дегидрогеназной активности клеток тест-культуры.

После этого во все пробирки вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест-культуры, т. е. предпоследнее разведение тест-культуры, взывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 час. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и соответствует «рабочей дозе» тест-культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 3-х часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют по 2,0 мл 1 % МПА с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют при 37 °С в термостате.

Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культуры и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (цвет — синий).

О степени активности антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культур через 1 или 2 часа инкубации в термостате при температуре 37 °С, по сравнению с контролем.

Качественное определение антибиотиков

Подготовленные к использованию испытуемые пробы в объеме 0,5 мл вносят в пробирки с таким же количеством МПБ и тщательно перемешивают.

Во все пробирки добавляют 0,5мл взвеси, содержащей двойную рабочую дозу тест-культуры.