Биологическая индикация радиационного воздействия на организм человека с использованием цитогенетических методов (стр. 4 )

Рисунок 2. Калибровочная кривая для частоты транслокаций с 95% доверительным интервалом

Таблица 8. Оценка дозы с 95% доверительным интервалом (Гр), определенная по частоте транслокаций, при различных количествах посчитанных клеток-эквивалентов Neq

Кол-во транслокаций	Посчитано клеток-эквивалентов Neq
100	200	300	400	500
2	н. д.	н. д.	н. д.	н. д.	н. д.
3	0,51 (0 – 1,04)	н. д.	н. д.	н. д.	н. д.
4	0,64 (0,12 – 1,17)	0,34 (0 – 0,76)	н. д.	н. д.	н. д.
5	0,76 (0,24 – 1,28)	0,43 (0,02 – 0,84)	0,27 (0 – 0,63)	н. д.	н. д.
6	0,87 (0,35 – 1,38)	0,51 (0,10 – 0,91)	0,34 (0 – 0,70)	0,24 (0 – 0,57)	0,16 (0 – 0,49)
7	0,96 (0,45 – 1,48)	0,58 (0,18 – 0,98)	0,40 (0,05 – 0,75)	0,29 (0 – 0,62)	0,21 (0 – 0,52)
8	1,05 (0,54 – 1,56)	0,64 (0,24 – 1,04)	0,46 (0,11 – 0,81)	0,34 (0,02 – 0,66)	0,26 (0,02 – 0,56)
9	1,13 (0,63 – 1,64)	0,70 (0,31 – 1,11)	0,51 (0,16 – 0,86)	0,39 (0,07 – 0,71)	0,30 (0 – 0,60)
10	1,21 (0,71 – 1,72)	0,76 (0,37 – 1,16)	0,55 (0,21 – 0,90)	0,43 (0,11 – 0,75)	0,34 (0,04 – 0,64)
11	1,28 (0,78 - 1,79)	0,82 (0,42 – 1,21)	0,60 (0,25 – 0,95)	0,47 (0,15 – 0,79)	0,38 (0,08 – 0,68)
12	1,36 (0,86 – 1,86)	0,87 (0,47 – 1,26)	0,64 (0,30 – 0,99)	0,51 (0,19 – 0,82)	0,41 (0,11 – 0,71)
13	1,42 (0,92 – 1,93)	0,92 (0,53 – 1,31)	0,68 (0,34 – 1,02)	0,54 (0,23 – 0,86)	0,45 (0,15 – 0,74)
14	1,49 (0,99 – 1,99)	0,96 (0,57 – 1,35)	0,72 (0,38 – 1,07)	0,58 (0,26 – 0,89)	0,48 (0,18 – 0,77)
15	1,55 (1,05 – 2,05)	1,01 (0,62 – 1,40)	0,76 (0,42 – 1,10)	0,61 (0,30 – 0,93)	0,51 (0,21 – 0,80)

н. д. – выявленная частота транслокаций не отличается достоверно от контрольного значения, p<0.05 (точный критерий Фишера)

В заключение необходимо подчеркнуть, что метод биодозиметрии, основанный на анализе частоты хромосомных аберраций, позволяет оценить поглощенную дозу, величина которой эквивалентна дозе однократного острого облучения (т. е. для тех условий облучения, при которых получена калибровочная кривая). Иными словами, можно оценить реакцию организма (уровень хромосомных нарушений) после радиационного воздействия в единицах дозы однократного облучения. Учитывая, что чаще всего приходится сталкиваться с ситуациями, когда имеет место хроническое или пролонгированное облучение, необходима корректировка полученных значений доз облучения. Так, например, для ориентировочного пересчета дозы при хроническом радиационном воздействии следует применять коэффициент 2-3 по отношению к острому облучению в той же дозе, независимо от длительности воздействия ионизирующего излучения (United Nations, 1988).

Эффективность использования методов цитогенетического анализа.

Коллектив авторов, участвовавших в разработке медицинской технологии, имеет большой опыт использования цитогенетических методов для оценки уровня облучения людей, пострадавших в результате различных радиационных аварий. Проведено обследование более 4000 участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС и жителей, проживающих на загрязненных в результате этой аварии территориях. Проведено обследование населения, проживающего в районе р. Теча (Челябинская обл.) и в районах, прилегающих к Семипалатинскому полигону (более 500 человек). В результате выявлены повышенные в несколько раз уровни нестабильных и стабильных аберраций хромосом по сравнению с контролем. Показано, что уровень клеток с дицентриками снижается во времени. При обследовании участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС отмечено, что в течение всего периода после радиационного воздействия (20 лет ), частота клеток с дицентриками превышает контрольный уровень. Выявлены (спустя 20-45 лет после радиационного воздействия) высокие уровни клеток с дицентриками и при обследовании населения, проживающего в Брянской области, в районе р. Теча, а также в Алтайском крае, что свидетельствует о длительном сохранении определенной доли клеток с нестабильными хромосомными аберрациями у людей, получивших достаточно высокие дозы облучения.

С помощью FISH метода оценены поглощенные дозы у участников ликвидации аварии на ЧАЭС. Диапазон полученных доз среди обследованных людей составил от фонового до 1 Гр. По частоте стабильных хромосомных аберраций оценены величины доз для жителей Алтайского края.

При обследовании группы профессионалов-атомщиков РФЯЦ-ВНИИЭФ (110 человек) был выявлен высокий уровень клеток с дицентриками, который достоверно отличается от аналогичного показателя для контрольной группы (жители г. Сарова). По частоте транслокаций с помощью калибровочной кривой «доза-эффект», для группы профессионалов-атомщиков были рассчитаны индивидуальные дозы облучения.

Список цитированной литературы

1.  , , Барановская человека (атлас). Издательство «Медицина», Москва. 19стр.

2.  Bauchinger M. Cytogenetic researches after accidental radiation exposure. // Stem Cells. – 1995. – V. 13, Suppl. 1. – P. 182 – 190.

3.  IAEA, Vienna, 1986, Technical Report Series N0 260, Biological dosimetry: Chromosomal aberration analysis for dose assessment. 68 p.

4.  .Lucas J. N., Awa A., Straume T., Poggensee M., Kodama Y., Nakano M., Ohtaki K., Weier H. U., Pinkel D., Gray J., et al Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionising radiation. // Int. J. Radiat. Biol. – 1992. – V. 62, N. 1. P. 53 – 63.

5.  Mendelsohn M. L., Mayall B. H., Bogart E., et al. DNA content and DNA-based centromeric index of 24 human chromosomes. // Science– V. 179, N. 78. – P. .

6.  Method of human chromosome aberration analysis. Edit by K. Backton., H. Evans. WHO, Geneva, 1976, 64 p.

7.  Pinkel D., Straume T., Gray J. W. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridisation. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 1986. –V. 83, N. 9. – P. 2934 – 2938.

8.  United Nations. Ionizing radiation. Sources and biological effects. UNSCER 1982, report to the General Assembly with annexes. United nations sales publication. E., United Nations, New York, 1982.

9.  United Nations. Sources, Effects and Risk of Ionizing Radiation. UN Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation (N. Y. United Nations, 1988).

Приложение

Приготовление необходимых реактивов

Фосфатный буфер (рН 6.8):

KH2PO4	2,45 г
Na2HPO4	5,70 г
H2O	5 л

Хранить при комнатной температуре.

10 ´ PBS:

Приготовить раствор А:

NaCl	73.84 г
Na2HPO4 * 2H2O	16.02 г
H2O бидистилл.	900 мл

Приготовить раствор В:

NaCl	16.56 г
NaH2PO4	2.76 г
H2O бидистилл.	100 мл

Довести при помощи раствора В рН раствора А до 7.0.

PBS:

Развести 10´PBS бидистиллированной водой в 10 раз (10 мл 10´PBS + 90 мл бидистиллированной воды). Хранить при комнатной температуре.

Краситель Hoechst 33258 (основной раствор)

Hoechst 33мг

H2 О бидистилл. – до 100 мл

Хранить при t +40С в темноте.

Краситель Hoechst 33258 (рабочий раствор)

Готовится ex temporo

Hoechst 33258 (основной раствор) - 2 мл

PBS - 98 мл

Краситель Гимза (5% раствор)

Готовится ex temporo

Краситель Гимза (основной раствор) - 5 мл

Фосфатный буфер, pH мл

20*SSC:

3.0 M NaCl, 0.3 M Na цитрат.

NaCl	175.32 г
Na цитрат (C6H5Na3O7*2H2O)	88.23 г
H2O бидистилл.	800 мл

Довести рН до 7.0. Затем бидистиллированной водой довести объем раствора до 1 литра.

2*SSC:

Развести 20*SSC бидистиллированной водой в 10 раз (10 мл 20*SSC + 90 мл H2O бидистилл.), довести рН до 7.0, профильтровать.

2 ´ PBS:

Развести 10´PBS бидистиллированной водой в 5 раз (20 мл 10´PBS + 80 мл H2O бидистилл.).

Раствор 1 М MgCl2:

MgCl2 * 6H2O	50.83 г
H2O бидистилл	250 мл

Раствор 10% пепсина:

100 мг пепсина растворить в 1 мл 0.01 N HCL.

Готовый раствор хранить при t = -20oC.

70% раствор формамида:

Формамид	70 мл
20*SSC	10 мл
H2O бидистилл.	20 мл
S	100 мл

Хранить в холодильнике при t = 4oC,

использовать в течение 1 – 2 недель.

Раствор PBS/ MgCl2:

1 М MgCl2	5 мл
10*PBS	10 мл
H2O бидистилл.	85 мл
S	100 мл

Готовится ex temporo.

Раствор параформальдегида (0.25% PFA):

0.250 г параформальдегида (PFA) растворить в 50 мл 100 мM MgCl2 , добавить 1 каплю 1 N NaOH, для лучшего растворения подогреть смесь на водяной бане до 70оС, после полного растворения параформальдегида добавить 50 мл 2*PBS. Раствор годен в течение недели, хранить при комнатной температуре.

Master Mix 1.0:

К 5 мл формамида добавить 1 г сульфата декстрана и 1 мл 20*SSC. Довести рН до 7.0 при помощи 1 N HCl. Бидистиллированной водой довести объем смеси до 7.0 мл. Для растворения сульфата декстрана смесь прогревать в течение нескольких часов при 700 С. Готовую смесь разлить по микропробиркам, хранить при -20 С. ММ1.0 может храниться нескольких месяцев.

50% раствор формамида:

Формамид	200 мл
20*SSC	40 мл
H2O бидистилл.	160 мл
S	400 мл

Разлить по 4 сосудам Коплина. Сосуды Коплина пронумеровать, растворы использовать согласно порядковым номерам. Использовать в течение месяца. Хранить в холодильнике при t = 4oC.

0.1*SSC:

Готовить ex temporo

20*SSC	1.5 мл
H2O бидистилл.	до 300 мл

Разлить по трем сосудам Коплина.

PN-буфер:

К 1 литру 0.1 M Na2HPO4 добавлять 0.1 M Na2HPO4 до тех пор, пока рН раствора не достигнет 8.0. Затем добавить Nonidet P-40 до конечной концентрации 0.1%. Хранить при комнатной температуре.

PNM-буфер:

Обезжиренное сухое молоко	5 г
1% раствор азида натрия	10 мл
PN-буфер	90 мл

К PN-буферу добавляют обезжиренное сухое молоко, азид натрия, перемешивают и оставляют в термостате при t = 37оС на ночь. Раствор центрифугируют, отбирают супернатант. PNM-буфер разливают по аликвотам в микропробирки и замораживают при t = -20оС.

Разведение стрептавидина и антистрептавидина:

Маточный раствор биотинилированного антистрептавидина и стрептавидина, конъюгированного с FITC[1] получают разведением согласно инструкции производителя. После разведения маточный раствор разливают по аликвотам в микропробирки и замораживают при t = -20оС.

Рабочая концентрация этих антител – 5мкг/мл в PNM-буфере.

Разведение антидигоксигенина и AMCA[2] конъюгированных антител IgG Rat-anti-Mouse и IgG Mouse-anti-Rat:

Маточные растворы получают разведением согласно инструкции производителя. После разведения маточные растворы разливают по аликвотам в микропробирки и замораживают при t = -20оС.

Рабочий раствор антидигоксигенина получают разведением 1 : 250 в PNM-буфере.

Рабочий раствор AMCA конъюгированных антител IgG Rat-anti-Mouse и IgG Mouse-anti-Rat получают разведением 1 : 50 в PNM-буфере.

0.5 М карбонат-бикарбонатный буфер:

0.42 г NaHCO3 растворить в 10 мл H2O бидистилл. Довести рН до 9.0 при помощи 50% NaOH.

Раствор Antifade[3]:

100 мг п-фенилендиамин дигидрохлорида растворить в 10 мл PBS. Довести рН до 8.0 при помощи 0.5 М карбонат-бикарбонатного буфера. Полученный раствор добавить к 90 мл глицерина. Хранить разлитыми по порциям по 1 мл в темноте при -20 С. Этот раствор темнеет со временем, но остается эффективным. Может храниться и использоваться более 6 месяцев.

Разведение основного раствора пропидий иодида:

Сухой пропидий иодид развести бидистиллированной водой до концентрации 1 мг/мл. Хранить в темноте при t = -20оС.

Рабочий раствор пропидий иодида в Antifade:

1 мкл пропидий иодида растворить в 1 мл раствора Antifade. Хранить в темноте при -20оС.

Метафазные пластинки в культуре лимфоцитов крови

FPG метод

Дицентрическая хромосома и парный фрагмент (указаны стрелками)

FISH метод

Реципрокные транслокации с участием 1 и 12 хромосом (указаны стрелками)

[1] FITC – изотиоцианат флуоресцеина

[2] - AMCA – 7-амино-4-метилкумарин-3-уксусная кислота

[3] - Можно использовать готовый коммерческий реактив VECTASHIELD (Vector Laboratories, Inc)