1. Простейшим является метод освобождения сывороток от неспецифических ингибиторов с помощью CO2. С этой целью к одному объему сыворотки добавляют 9 объемов дистиллированной воды. Пропускание углекислоты через цельные или разведенные физиологическим или гипотоническим растворами сыворотки не дает части ингибиторов выпасть в осадок. CO2 пропускают в течение 5...7 мин из аппарата Киппа до интенсивного помутнения сыворотки. Вместо газообразной углекислоты можно использовать кусочки сухого льда размером с горошину, которые вносят в пробирку с небольшим интервалом, чтобы избежать пенообразования; для освобождения от образовавшихся хлопьев мукополисахаридов, содержащих неспецифические ингибиторы, пробирки с сывороткой центрифугируют при об/мин в течение 10...20 мин, надосадочную жидкость отсасывают и для восстановления физиологической концентрации соли добавляют 8,5%-ный раствор натрия хлорида (1:10 объема). Сыворотки, обработанные углекислотой, не требуют прогревания, так как они освобождаются от термостабильных и термолабильных ингибиторов одновременно. Обработка сывороток CO2 практически не снижает титр специфических антигемагглютининов.
2. Разрушение ингибиторов фильтратом холерного вибриона. К 1 объему прогретой при 56°С в течение 30 мин сыворотки добавляют 4 объема фильтрата холерного вибриона и смесь инкубируют в течение 18...20 ч при 37 °С. После этого сыворотку вновь прогревают 1 ч при 56 °С. Обработанная таким образом сыворотка считается разведенной 1:5.
3. Удаление ингибиторов каолином. К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,8 мл физиологического раствора, прогревают при 56 °С в течение 30 мин и добавляют 1 мл 25%-ной взвеси каолина на физиологическом растворе. Смесь встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют 10-20 мин при 2000 об/мин. После обработки сыворотка разведена 1:10. Удаление ингибиторов с помощью каолина можно изменить, обрабатывая сыворотку непосредственно в панелях для микротитрования. Для этого в 1-ый ряд лунок вносят предварительно прогретые исследуемые сыворотки в объеме 0,02 мл 3 добавляют к ним 0,18 мл 12,5%-ной суспензии каолина. После встряхивания и центрифугирования пластины на специальной центрифуге осуществляют двукратные разведения абсорбированной сыворотки путем переноса петлей из лунки в лунку.
4. Разрушение ингибиторов периодатом калия. Готовят 0,05 М раствор периодата калия на дистиллированной воде. Для этого 1,15 г периодата калия (KJ04) растворяют в 100 мл дистиллированной воды при подогревании в водяной бане (70...80 °С) в течение 2...5 мин до получения прозрачного раствора. Для разрушения ингибиторов к одному объему неразведенной предварительно прогретой при 56 °С в течение 30 мин сыворотки крови добавляют один объем раствора периодата калия. Смесь оставляют при комнатной температуре на 2 ч, затем добавляют два объема 5%-ного раствора глюкозы для нейтрализации действия периодата калия (сыворотка разведена 1:4).
Компоненты РЗГА: 1-й вариант постановки — исследуемый вируссодержащий материал; диагностическая иммунная сыворотка; 1%-ная взвесь эритроцитов; 2-й вариант— исследуемая сыворотка крови; стандартный антиген (вирусный диагностикум); 1%-ная взвесь эритроцитов.
Постановка РЗГА включает следующие этапы: определение рабочей дозы вируса (1 ГАЕ), определение правильности выбора 4 ГАЕ и проведение основного опыта РЗГА. Вначале в РГА определяют 1 ГАЕ, а для основного опыта используют от 2 до 8 ГАЕ, чаще всего 4 ГАЕ. Например, если 1 ГАЕ вируса соответствует разведению 1:160, то при подготовке рабочей дозы (4 ГАЕ) вирус разводят 1:40. Вирус в рабочем разведении готовят в объеме, необходимом для проведения основного опыта. Для приготовления рабочего разведения 1:40 берут 1 мл исходного вируса и 39 мл физиологического раствора. Правильность приготовления рабочей дозы (4 ГАЕ) определяют в дополнительном опыте. Для этого используют пластмассовую панель. В лунки панели, начиная со второй и включая шестую (контроль), вносят по 0,1 мл физраствора. Затем в первую лунку вносят 0,1 мл вируссодержащего материала (4 ГАЕ) и делают последовательные переносы. Из пятой лунки 0,1 мл выливают в дезраствор, в контрольную вирус не добавляют. Получают разведения вируссодержащего материала в 4 ГАЕ, 2 ГАЕ, 1 ГАЕ, 0,5 ГАЕ и 0,25 ГАЕ. Затем в каждую лунку, в том числе и контрольную, вносят по 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур. Реакцию оставляют при комнатной температуре на 45...50 мин и проводят учет (табл.7). При правильном выборе 4 ГАЕ в первых двух лунках — агглютинация эритроцитов на 3+, в третьей (1 ГАЕ) — 2+, в контроле агглютинация отсутствует.
Таблица 7
Проверка правильности выбора 4 ГАЕ
Компоненты | Номера лунок | |||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Контроль | |
Физраствор | - | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Вирус | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | в дезраствор |
ГАЕ | 4 | 2 | 1 | 0,5 | 0,25 | |
1%эритроциты кур | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Экспозиция 45…50 мин при комнатной температуре | ||||||
Учет результатов | +++ | +++ | ++ | + | - | - |
Основной опыт РЗГА (для определения антител в исследуемой сыворотке). В лунки пластмассовой панели разливают по 0,1 мл физиологического раствора. Затем в первую лунку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и делают последовательные ее переносы. Из последней лунки 0,1 мл разведенной сыворотки выливают в дезраствор. Таким образом, получают разведения исследуемой сыворотки от 1:2 до 1:256. В каждую лунку вносят по 0,1 мл вируссодержащего материала в 4 ГАЕ и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. По истечении этого времени в каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур и снова оставляют при комнатной температуре.
Одновременно ставят контроли: а) контроль сыворотки (0,1 мл разведенной 1:10 сыворотки крови и 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур);
б) контроль эритроцитов (0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур и 0,1 мл физраствора);
в) контроль вируса (0,1 мл антигена в 4 ГАЕ и 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур).
Панели встряхивают и после 30...60 мин контакта учитывают реакцию (табл.8).
Таблица 8
Основной опыт РЗГА для определения антител
Компоненты | Номера лунок | Контроли | |||||||||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Сыв-ки | Эритроцитов | Вируса | |||||||||||
Физраствор | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | |||||||||||||
Исследуемая сыворотка | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | В. дезраствор | |||||||||||
Получаемые разведения | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | |||||||||||||
Вирус 4ГАЕ | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | ||||||||||||
Экспозиция 20 мин при комнатной температуре | |||||||||||||||||||||
1%взвесь эр-цитов кур | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | ||||||||||
Экспозиция 30...60 мин при комнатной температуре | |||||||||||||||||||||
результаты | - | - | - | - | - | + | ++ | +++ | - | - | +++ | ||||||||||
Учет результатов начинают с контролей. Они должны показать результат, отраженный в табл.8. При наличии соответствующих антител в исследуемых сыворотках происходит нейтрализация гемагглютинирующей активности вируса и задержка агглютинации эритроцитов. В первых лунках наблюдают положительную РЗГА: эритроциты оседают на дно лунки в виде компактной точки. В последующих лунках, где имеет место снижение титра антител, отмечают отрицательную РЗГА — агглютинация эритроцитов на 1,2 и 3 плюса. В 1-ом и 2-ом контролях агглютинация должна отсутствовать, а в 3-ем — агглютинация эритроцитов должна быть не менее, чем на 3 плюса.
РЗГА позволяет не только выявить специфические антитела, но и определить их титр. Титром антител в РЗГА называют наименьшее их количество, способное полностью задержать гемагглютинацию. В нашем примере (табл.8) титр антител составляет 1:32.
Реакция задержки гемадсорбции (РЗГад).
Ее применяют для обнаружения, идентификации и типизации вирусов в зараженной культуре клеток.
Суть ее состоит в том, что антитела иммунной сыворотки, взаимодействуя с антигеном гемагглютинирующих вирусов, размножающихся в культуре клеток, экранируют их, и в результате адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток не наблюдается.
Компоненты реакции:1) инфицированная и неинфицированная гемагглютинирующим вирусом культура клеток в пробирках; 2) Диагностическая противовирусная сыворотка; 3) 0,4%-ная взвесь эритроцитов кур.
Техника постановки. Из пробирок с культурой клеток сливают питательную среду, отмывают клетки от ее белковых компонентов, добавляя в пробирки 2-3 мл раствора Хенкса. После 1...2 мин экспозиции раствор Хенкса удаляют. Затем в каждую опытную и контрольную пробирки вносят по 0,2 мл диагностической сыворотки. Пробирки оставляют в наклонном положении, полосой вверх, и выдерживают при комнатной температуре 15...20 мин. Затем добавляют по 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов и снова оставляют на 3...5 мин в наклонном положении при комнатной температуре. В дальнейшем пробирки осторожно вращают 5-10 раз с целью ресуспендирования осевших, но не адсорбировавшихся эритроцитов.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
