Схема титрования гемолизина

Компоненты, мл	Разведения
1:1000	1:1500	1:2000	1:3000	1:4000	1:5000	1:6000	1:7000
Гемолизин	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Физраствор (вместо антиге-на и сыворотки)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Комплемент 1:20	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
2% взвесь эритроцитов	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Водяная баня 10 мин при 37 °С
Учет титрования	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧЗГ	ЗГ	ЗГ	ЗГ

Обозначения: ПГ — полный гемолиз; ЧЗГ — частичная задержка гемолиза; ЗГ — задержка гемолиза.

При этом необходимы следующие контроли: 1) контроль эритроцитов для исключения спонтанного гемолиза (0,5 мл 2%-ной суспензии эритроцитов + 2 мл физиологического раствора); 2) контроль гемолизина для исключения гемолиза эритроцитов без комплемента (0,5 мл разведения 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 2%-ной взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора); 3) контроль комплемента для исключения гемолиза эритроцитов без участия гемолизина (0,5 мл 1:20 комплемента + 0,5 мл 2%-ной взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора); 4) контроль гемолитической системы (0,5 мл разведения 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 2%-ной взвеси эритроцитов + 0,5 мл разведения 1:20 комплемента — 1мл физиологического раствора).

При титровании устанавливают предельный титр гемолизина, т. е. его минимальное количество, способное вызвать лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В нашем примере (табл.13) — это количество гемолизина в разведении 1:3000. В первых трех контролях должна быть полная задержка гемолиза, в четвертом контроле — полный гемолиз.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

В главный опыт берут 4-х-кратную концентрацию гемолизина от его предельного титра. Значит, рабочее разведение будет 1:750. А если он консервирован глицерином (1:1), то для приготовления рабочего разведения берут 2:750 или 0,2 мл цельного гемолизина и 74,8 мл физиологического раствора.

2. Приготовление гемолитической системы. Смешивают гемолизин в рабочем титре с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов барана. Перед использованием гемолитическую систему выдерживают в термостате 30 мин при 37 °С для сенсибилизации эритроцитов.

3. Приготовление 2%-ной суспензии эритроцитов. К 2 мл осадка отмытых эритроцитов барана добавляют 98 мл физиологического раствора.

4. Титрование комплемента. Комплемент титруют в гемолитической системе в день главного опыта по схеме, приведенной в (табл.14).

Таблица 14

Схема титрования комплемента

Компоненты, мл	Содержание цельного комплемента, %
0 0,5	1,0	1,5	2,0	2,5	3,0	3,5	4,0	4,5
Комплемент 1:20	0 0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45
Физраствор, недостающий до 0.5 мл	00,45	00,4	00,35	00,3	00,25	00,2	0,15	00,1	0,05
Гемолитическая система	11,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Физраствор (вместо антигена и сыворотки)	11,0	1,0	1,0	11,0	11.0	11,0	1,0	11,0	11,0
Водяная баня 15 мин при 37...38 °С
Учет титрования	ЗГ	ЗГ	ЗГ	ЧЧЗГ	ПГ	ППГ	ПГ	ППГ	ППГ

Обозначения: см. в табл.13.

Титром комплемента считают то его наименьшее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. При определении типа вируса ящура используют комплемент с титром, не ниже 2,5 %.

Для постановки главного опыта РСК комплемент берут с избытком в 1% или в две условные единицы от его титра в гемсистеме. Например, титр комплемента в гемсистеме 2 %, в главный опыт берут 3 %. Для приготовления рабочей дозы к 3 мл нативного цельного комплемента добавляют 97 мл физиологического раствора.

Приготовление разведении комплемента, определение его активности и вычисление рабочей дозы требуют в подготовке РСК наибольшего внимания. Правильно выбранная рабочая доза комплемента — непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов.

При определении типа вируса ящура типоспецифические сыворотки и стандартные антигены, выпускаемые биофабриками, используют в удвоенном предельном титре. Например, если титр сыворотки, указанный на этикетке, равен 1:40, рабочий титр равен 1:20.

5. Постановка главного опыта. Одновременно с главным опытом ставят контроль всех специфических ящурных антигенов и сывороток согласно схеме (табл.15). Компоненты разливают в следующем порядке:

1) специфические сыворотки в рабочем титре по 0,2 мл для каждой сыворотки — один ряд по вертикали;

2) специфические антигены в рабочем титре по 0,2 мл — в первые семь рядов по горизонтали, для каждого антигена один ряд;

3) испытуемый антиген в разведениях по 0,2 мл — для каждого разведения один ряд пробирок по горизонтали;

4) физиологический раствор по 0,2 мл — в последний ряд по горизонтали (контроль сывороток) вместо антигена и в последний ряд по вертикали (контроль антигенов) вместо сывороток;

5) комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении — во все пробирки главного опыта.

Пробирки осторожно встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин при 37...38°С.

6) во все пробирки наливают по 0,4 мл гемолитической системы. Пробирки снова встряхивают и ставят в водяную баню на 30 мин при 37...38 °С.

Учет реакции проводят через 5—10 мин после водяной бани и окончательный результат получают через 10—12 ч. Степень задержки гемолиза оценивают в плюсах:

++++ — 100%-ная задержка; +++ — 75%-ная задержка;

++— 50%-ная задержка; +— 25%-ная задержка; — полный гемолиз.

Если испытуемый антиген гомологичен специфическим антителам, то будет задержка гемолиза и реакция считается положительной: если же гомологичные антитела отсутствуют — реакция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.

При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его вариант. Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антигены — в удвоенном.

Микрометод РСК. В последнее время для количественного учета РСК применяют технику постановки реакции в малых объемах, Для этого используют наборы панелей с V-образной конфигурацией лунок и калиброванных капельных пипеток системы Такачи. Реакцию ставят в объеме 0,125 мл, т. е. в 8 раз меньшем, чем при описанном выше методе. Каждый компонент берут в объеме 0,025 мл.

Таблица 15

Схема главного опыта РСК по определению типа вируса ящура

Антигены	Рабочий титр Антиге нов	Сыворотки	Конт роль антиге нов
А титр 1:30	0 титр 1:40	С титр 1:20	Азия-1 титр 1:30	Сат-1 титр 1:30	Сат-2 титр 1:20	Сат-3 титр 1:30
Рабочий титр сывороток
1:15	1:20	1:10	1:15	1:15	1:10	1:15
А, титр 1:4	1:2	++++	-	-	-	-	-	-	-
0, титр 1:6	1:3	-	++++	-	-	-	-	-	-
С, титр 1:8	1:4	-	-	++++	-	-	-	-	-
Азаия-1, титр 1:8	1:4	-	-	-	++++	-	-	-	-
Сат-1, титр 1:8	1:4	-	-	-	-	++++	-	-	-
Сат-2, титр 1:8	1:3	-	-	-	-	-	++++	-	-
Сат-3, титр 1:8	1:2	-	-	-	-	-	-	++++	-
Испытуемый антиген	ц	++++	-	-	-	-	-	-	-
1:2	+++	-	-	-	-	-	-	-
1:4	++	-	-	-	-	-	-	-
1:8	-	-	-	-	-	-	-	-
Контроль сывороток		-	-	-	-	-	-	-	-

Примечание: все стандартные антигены и сыворотки активны и специфичны. Испытуемый антиген относится к типу А.

Техника подготовки реагентов, приготовление стандартов и постановка реакции такие же, как и при макрометоде. Небольшой расход реагентов и быстрота разлива компонентов капельными микропипетками делают микрометод очень удобным при постановке перекрестных реакций, когда определяют антигенное родство нескольких штаммов.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Приготовить антиген для РСК из патологического материала. 2. Поставить главный опыт РСК с целью определения типовой принадлежности вируса ящура. 3. Провести учет реакции и дать заключение.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.2. Объяснения преподавателя.3. Демонстрация учета титрования гемолизина и комплемента в индикаторной системе. 4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Учебную группу целесообразно разделить на 4 подгруппы. Студенты получают от преподавателя все компоненты РСК в рабочих разведениях, кроме испытуемого антигена. Преподаватель предварительно проводит разведения всех компонентов (набор диагностикумов для РСК, выпускаемый биологической промышленностью) до рабочего титра и проверяет их в РСК.

Учет и интерпретацию результатов желательно проводить с каждой подгруппой, записывая их результаты на доске по схеме с последующим коллективным обсуждением.

Вопросы домашнего задания

1. Вирусы болезни Ауески и бешенства. 2. Назначение и сущность РКОА3. Компоненты РКОА. Схема постановки и учета РКОА.

ЗАНЯТИЕ 20. Реакция коагглютинации (РКОА)

Цель занятия: изучить сущность, технику постановки и учета РКОА.

Оборудование и материалы: суточная агаровая культура золотистого стафилококка (штамм Cowan-1), жидкая пептонно-дрожжевая среда, центрифуга, фосфатно-буферный раствор рН 7,2...7,4, 0,3...3%-ный раствор формальдегида, антительный эритроцитарный диагностикум для протеина А стафилококка, 0,1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, мертиолят натрия, исследуемые биологические жидкости, микропанели для титрования, аппарат Такачи, таблицы по теме.

Краткие теоретические сведения

Реакция коагглютинации (РКОА) находит широкое применение для идентификации вирусов гриппа, герпеса, онкогенных вирусов, ротавирусов и др. Достоинства РКОА: а) высокая экономичность (в 50-250 раз дешевле других методов); б) высокая чувствительн -

ость, не уступающая в ряде случаев ИФА; в) простота постановки (отсутствие необходимости в дорогом оборудовании для приготовления реагентов и учета реакции).

Рис.68. Принцип реакции коагглютинации: 1 — золотистые стафилококки (штамм Cowan-1); 2 — белок А; 3 — Fc-фрагмент антител; 4 — Fob-фрагменты антител; 5 — антиген; 6 — феномен коагглютинации

Сущность РКОА состоит в том, что белок А (видоспецифический протеин) золотистого стафилококка обладает способностью соединяться с Fc-фрагментом IgG человека и ряда млекопитающих, в т. ч. лабораторных животных — продуцентов антител (кроликов, морских свинок, крыс, мышей, коз и т. д.). Белок А способен реагировать не только со свободными молекулами иммуноглобулинов, находящимися в растворе, но и с иммуноглобулинами, фиксированными на клеточных поверхностях, находящихся в составе иммунного комплекса. При этом Fab-фрагменты остаются свободными для реакции с гомологичными антигенами (рис.68).

В постановке данной реакции модно выделить три основных этапа: 1) получение активной и стабильной по содержанию белка А взвеси золотистого стафилококка; 2) определение требований к иммунной сыворотке, используемой для сенсибилизации стафилококка, а также правильное проведение процесса сенсибилизации; 3) постановка реакции и учет ее результатов.

Получение взвеси золотистого стафилококка. Присутствие белка А является видоспецифическим признаком золотистого стафилококка, однако в качестве продуцента чаще используют St. aures (штамм Cowan-1), наиболее богатый этим белком. Приготовление реагента для коагглютинации состоит в предварительной обработке клеток для лучшего закрепления на их поверхности белка А и предупреждения потери активности при длительном хранении суспензии.

Суточную агаровую культуру золотистого стафилококка засевают в жидкую пептонно-дрожжевую среду и выращивают в течение 12.„14 ч при усиленной аэрации (встряхивание на шуттельаппарате при 100 толчках в мин). Сокращенное время культивирования обеспечивает максимальное накопление белка А в клетках. Пептонно-дрожжевую среду готовят по следующей прописи:

пептон — 10 г, дрожжевой экстракт — 5 г, глюкоза — 2 г, двузамещенный фосфат калия — 3 г, дистиллированная вода — 1л. Среду стерилизуют в течение 30 мин при 0,05 МПа, рН после этого составляет 7,2—7,4. Посевная доза — смыв с одного косяка на 2 л питательной среды.

Бактериальные клетки осаждают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и дважды отмывают от питательной среды фосфатно-буферным раствором (ФБР) с рН 7,2.-.7,4. Из осадка готовят 10%-ную суспензию на ФБР. Эту суспензию микробов фиксируют 1%-ным раствором формальдегида в течение 3 ч при постоянном перемешивании. Затем бактериальные клетки четырежды отмывают ФБР от формальдегида, суспензию разводят до 10 %-ной концентрации и прогревают при 60 °С в течение 1 ч для снижения протеолитической активности. Затем клетки еще раз промывают, суспендируют в ФБР, добавляют мертиолят натрия (1:10000) и хранят до 2-х месяцев при 4...6 °С. Более длительное хранение в жидком виде нежелательно, так как может снизиться активность белка А.

Необходимое условие успешной обработки стафилококковых клеток — проверка биологической активности белка А на всех этапах. Для этой цели предложено несколько препаратов. Все они представляют собой эритроциты или частицы латекса, сенсибилизированные гамма-глобулиновой фракцией сыворотки крови. По степени агглютинации нагруженных частиц определяют титр белка А. Достаточно активными считают стафилококковые препараты с титром 1:2000 и выше. Методика приготовления эритроцитарного диагностикума и постановка РНГА— см. тему "РНГА". Обработанные клетки золотистого стафилококка носят название "стафилококковый реагент".

Сенсибилизация стафилококков. Для получения коагглютинирующего реагента взвесь стафилококков обрабатывают иммунной сывороткой против искомого объекта исследования. Сыворотку следует брать от животного, IgG которого обладают сродством к белку А стафилококка. Наиболее активны по отношению к нему иммуноглобулины человека, свиньи, собаки и морской свинки, менее — осла и кролика, а IgG овцы, лошади, козы, крысы и мыши взаимодействуют с ним очень слабо.

Сыворотка должна быть строго специфичной, т. е. не содержать антител к другим компонентам вируссодержащего материала. Это достигается высокой степенью очистки вируса, используемого для иммунизации, либо абсорбцией сыворотки неинфицированной культурой ткани, на которой получен вирус, либо сочетанием обоих этих методов.

Сыворотка, используемая в РКОА, не должна содержать антител к стафилококку, так как это приводит к неспецифическим реакциям. Контроль проводят путем смешивания на стекле по 1 капле сыворотки и 10%-ной суспензии стафилококкового реагента. Если по истечении 3...5 мин не наблюдают образования хлопьев, то сыворотку считают пригодной для реакции.

Если образец сыворотки агглютинирует стафилококк, то проводят абсорбцию сывороток взвесью стафилококковых клеток, не имеющих белка А (например, штаммом Wood-46). Таким путем удаляют антитела, реагирующие со стафилококком за счет Fab -фрагментов, не затрагивая специфических противовирусных антител, реагирующих с белком А за счет ГС-фрагментов. Абсорбцию проводят, смешивая равные объемы сыворотки и 10%-ной суспензии стафилококка штамма Wood-46. Смесь инкубируют 30.„40 мин при 20...25 °С, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для сенсибилизации стафилококкового реагента.

Методика сенсибилизации стафилококков чрезвычайно проста, не требует специального оборудования и реактивов. Основное условие-подбор оптимальных доз и концентраций компонентов, т. е. сыворотки и стафилококкового реагента. Рассмотрим несколько вариантов приготовления коагглютинирующих реагентов для различных вирусных объектов.

Для идентификации вируса гриппа смешивают равные объемы иммунной кроличьей сыворотки в разведении 1:20 и 10%-ной суспензии стафилококкового реагента. Смесь инкубируют при 20...25 °С в течение 30 мин, затем дважды отмывают ФБР, доводят суспензию до концентрации 0,5% и консервируют 0,1%-ным раствором азида натрия - Полученный реагент может храниться несколько месяцев.

Для идентификации ротавирусов смешивают 0,3 мл неразведенной иммунной кроличьей сыворотки и 0,4 мл 50%-ной суспензии стафилококкового реагента. Смесь инкубируют при 25 °С в течение 5 мин, затем отмывают и готовят 2%-ную суспензию.

Постановка реакции и учет результатов. В отличие от бактериальных объектов, где можно использовать чистую культуру, вирусы всегда определяют в каком-либо биологическом материале. В этом случае для исключения неспецифических реакций необходимо провести абсорбцию этого материала суспензией стафилококка. Для этого смешивают равные объемы 10%-ной взвеси стафилококкового реагента и испытуемого материала, в котором предполагается наличие вируса. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, центрифугируют и надосадочную жидкость используют в РКОА.

Постановка РКОА состоит в смешивании на стекле равных объемов испытуемого материала и коагглютинирующего реагента. Результаты реакции учитывают визуально на темном фоне после 2..-3 мин интенсивного перемешивания. Темный фон — необходимое условие учета реакции, так как при наблюдении в проходящем свете может быть заметна мелкодисперсная агглютинация стафилококковых клеток. Реакцию учитывают по 3-х балльной системе:

+++ — интенсивное просвечивание реакционной смеси с образованием хлопьев (резко положительная реакция);

++ — отчетливое просветление смеси (положительная реакция);

+ — еле заметное просветление смеси (слабо положительная реакция);

- — отсутствие просветления (отрицательная реакция). Каждый опыт сопровождают следующими контролями: 1) стафилококковый реагент, сенсибилизированный нормальной (или гетерологичной) сывороткой + испытуемый материал; 2) используемый коагглютинирующий реагент + материал, заведомо не содержащий вируса; 3) коагглютинирующий реагент + фосфатнобуферный раствор; 4) испытуемый материал + фосфатно-буферный раствор. Все контроли должны проработать отрицательно.

Модификации постановки РКОА:

1) прямой метод. Коагглютинирующим реагентом обрабатывают инфицированную культуру клеток в течение 30 мин при 20 °С. Затем смесь отмывают и исследуют под микроскопом. Вокруг инфицированных клеток отчетливо виден "ореол" стафилококка, что свидетельствует о наличии вирусных антигенов;

2) непрямой метод. На культуру клеток, инфицированную вирусом, наносят иммунную сыворотку, а затем — стафилококковый реагент. Остальные этапы проводят аналогично прямому методу. Непрямой метод позволяет диагностировать вирусную инфекцию клеток уже через 12 ч после инфицирования, тогда как прямой метод — через 18 ч.

Специфичность РКОА контролируют путем постановки реакции в следующих системах: 1) инфицированные клетки + нормальная кроличья сыворотка + стафилококковый реагент; 2) неинфицированные клетки + иммунная сыворотка + стафилококковый реагент. Наличие агглютинации в опытной системе и отсутствие ее в двух контрольных свидетельствует о специфичности реакции.

При соблюдении всех требований к иммунным сывороткам, а также оптимальных условий сенсибилизации РКОА высокоспецифична—наблюдается 1-2 % ложноположительных результатов. Чувствительность этой реакции достаточно высока. Она не уступает иммунологическим методам "третьего поколения" (РИМ, ИФМ и др.) и значительно превосходит некоторые реакции "второго поколения".

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомить студентов с компонентами для проведения РКОА.

2. Поставить РКОА на стекле.

3. Провести учет РКОА.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация компонентов для проведения РКОА; техники постановки и учета РКОА-

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

Методические указания

Студентов желательно распределить на 4 подгруппы. Каждую обеспечить исследуемым антигеном, иммунной сывороткой г 10%-ной взвесью стафилококка. Под контролем преподавателе студенты самостоятельно готовят стафилококковый реагент, ставят и учитывают реакцию.

Учебно – методические материалы по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по курсу вирусологии (стр. 6 )

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

ОГЛАВЛЕНИЕ

Домашний очаг

Справочная информация

Техника

Общество

Образование и наука

Мир

Бизнес и финансы