Учебно – методические материалы по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по курсу вирусологии (стр. 1 )

Д. А. ВАСИЛЬЕВ В. Ю. ЛУГОВЦЕВ

УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ ВИРУСОЛОГИИ

часть вторая –

- СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ

ВИРУСОЛОГИИ

(часть вторая – серологические реакции)

Для студентов факультета ветеринарной медицины

Составители: Д. А. ВАСИЛЬЕВ В. Ю. ЛУГОВЦЕВ

УЛЬЯНОВСК 2005

УДК 619 : 616

Д. А. ВАСИЛЬЕВ В. Ю ЛУГОВЦЕВ

УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ ВИРУСОЛОГИИ

ЧАСТЬ ВТОРАЯ

Данное учебное пособие подготовлено: д б н, профессором (Ульяновская государственная с-х академия) и DVM, PhD Ю (Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, Laboratory of Pediatric Respiratory Viral Diseases. Bethesda, MD 20892, USA)

Цель издания – восполнить существующий пробел в учебном процессе при изучении материала по лабораторному практикуму курса ветеринарная вирусология. Некоторые разделы изложены более детально, а по некоторым дан описательный материал, что обусловлено лабораторными возможностями кафедры.

Рекомендовано к изданию кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии ветеринарно – санитарной экспертизы для студентов факультета ветеринарной медицины. Рецензент – профессор

ЗАНЯТИЕ 14. Диагностические реакции РГА и РГАд.

Цель занятия: изучить сущность и технику постановки ре­акции гемагглютинации (РГА) и гемадсорбции (РГАд).

Оборудование и материалы: вирус Ньюкаслской болезни (вакцинный штамм), физиологический раствор, 1%-ная суспензия эритроцитов кур, пластиковые панели с лунками, пипетки гра­дуированные на 1 мл (дозаторы пипеточные), резиновые груши, сосуд с дезинфицирующим раствором, не инфицированная и ин­фицированная вирусом ньюкаслской болезньи культура клеток в пробирках.

Краткие теоретические сведения

В вирусологической практике широко применяются реак­ции, основанные на индикации вирусных гемагглютининов. Они получили название диагностических и основаны на способности вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов, вызывая их склеивание. Это реакции гемагглютинации и гемадсорбции. Реак­ция гемагглютинации (от греч. Наето - кровь и лат. agglutio — склеивать) - реакция склеивания эритроцитов (РГА).

В 1941 г. Херст, Мак Клиленд и Хейр показали, что вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур. Впоследствии было показано, что агглютинацию эритроцитов вызывают очень многие, если вообще не все вирусы, относящиеся к большинству известных в настоящее время групп вирусов животных. Было также обнаружено, что некоторые вирусы обладают способностью вызывать адсорбцию эритроцитов на поверх­ности зараженных ими клеток, растущих в однословных культурах. Это явление было названо гемадсорбцией. Оказалось, что вызываемые вирусами гемагглютинация и гемадсорбция представляют собой весьма полезные инструменты для изучения вирусов, применимые в вирусологических исследованиях самого различного рода. Ниже мы перечислим те области, в которых эти реакции находят применение.

А. Выделение вирусов. Гемагглютинация и гемадсорбция широко используются для выявления миксовирусов как в жидкостях зараженных куриных эмбрионов (гемагглю-тинация), так и в зараженных клетках культур тканей (гемадсорбция). Некоторые миксовирусы можно выявить только с помощью гемагглютинации либо гемадсорбции. Ряд вирусов этого типа впервые обнаружили именно с помощью данных методов. Гемадсорбцию используют также для обнару­жения вирусов, относящихся к другим классификационным группам (напри­мер, к семейству вирусов оспы).

Б. Идентификация вирусов. Гемагглютинация и гемадсорбция (конечно, если вирус дает эти фено­мены) — обычно наилучший способ определения серотипа и классификацион­ной принадлежности вируса. В основе наиболее точного метода иден­тификации вирусов этого типа лежат реакции торможения гемагглютинации или гемадсорбции. Однако для предварительной идентификации и класси­фикации иногда пользуются иными «маркерами» гемагглютинации. К их числу относится избирательная способность вируса агглютинировать эритро­циты животных, титр реакции гемагглютинации, а также оптимальное значение рН и оптимальная температура реакции (4 или 37 °С).

В. Классификация вирусов. Установлено, что особенности гемагглютинации вирусов служат хорошей основой для разделения их на группы и подгруппы. Например, то, что виру­сы, вызывающие столь различные заболевания, как грипп, свинка и ньюкаслская болезнь, были отнесены к одной классификационной группе, яви­лось в основном результатом изучения их поведения в реакции гемагглютинации. В качестве классификационных критериев используют тесты на сте­пень перекрестного торможения гемагглютннации, а также «маркеры» гемаг­глютинации, упомянутые выше.

Г. Обнаружение антител. Из всех реакций, в основе которых лежит гемагглютинирующая способ­ность вирусов, наиболее широкое применение для выявления и титрования противовирусных антител благодаря своей простоте находит реакция тор­можения гемагглютинации. Широта спектра специфичности антител, выяв­ляемых с помощью этой методики, сильно варьирует и определяется в основ­ном классификационной принадлежностью вирусов. Например, при заболе­ваниях, вызываемых вирусами оспы, с помощью этой реакции выявляются группоспецифичные антитела, тогда как при заболеваниях, вызываемых аденовирусами,— типоспецифичные. Антитела, образующиеся в организме искусственно иммунизированных животных, судя по реакции торможения гемагглютинации, иногда более специфичны, чем антитела, появляющиеся в организме животных, заразившихся естественным путем. Обычно антитела к вирусам, дающим реакцию гемагглютинации, можно титровать с помощью реакции торможения гемагглютинации. Однако это не всегда удается, так как в некоторых случаях в сыворотках содержатся неспецифичные ингибиторы! гемагглютинации, которые не удается удалить ни одним из известных методов.

Д. Концентрирование и очистка вирусов. Некоторые вирусы, вызывающие агглютинацию эритроцитов, элюируются с их поверхности при условиях, существенно отличающихся от условий, при которых происходит максимальная адсорбция. Это свойство часто используют на практике. Так, оно лежит в основе относительно простого* метода конце нтрирования и очистки вирусных суспензий. Многие вирусы адсорбируются на эритроцитах при 4 °С, а элюируются при 37 °С, и наобо­рот. Вирусную суспензию можно смешать с эритроцитами при температуре, оптимальной для адсорбции, затем эритроциты осадить центрифугированием и промыть. Если после этого изменить температуру, то вирус элюируется с эритроцитов, в результате чего получается суспензия вируса, относительно-свободная от сопутствующего материала. При желании объем элюирующей жидкости можно уменьшить. Теоретически для концентрнрования и очистки вирусов можно использовать методы, в основе которых лежат иные способы воздействия на процессы адсорбции и элюции вирусов.

Е. Изучение структуры и функции вирионов. Реакция гемагглютинации в сочетании с электронной микроскопией и биохимическими методами исследования является ценным методом изучения структуры и функции вирионов. Теперь, например, стало ясно, что в случае вируса кори и аденовирусов способностью агглютинировать эритроциты обладают не только сами вирионы, но также частицы величина которых значительно меньше, чем величина интактных вирионов Впо­следствии во многих лаборатори­ях. РГА широко используется в вирусологической тактике как быстрый, технически простой и надёжный метод для обнаруже­ния гемагглютинирующих вирусов в исследуемом вируссодержащим материале, а также для титрования вирусных гемагглюти­нинов.

РГА неспецифична. Механизм реакции состоит в адсорбции вируса на поверхности эритроцитов в результате физико-химического процесса, зависящего от разности зарядов и других сил межмолекулярного притяжения. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок. Агглютинацию эритроцитов вызывают вирусы, содержащие антиген гемагглютинин. Агглютинация эритроцитов — явление, состоящее из трех фаз. В первой фазе происходит адсорбция вируса на эритроцитах. Затем во второй фазе агглютинация эритроцитов с адсорбированным вирусом. Может наступить и третья фаза — элюции (освобо­ждения) вируса от эритроцитов.

Факторы, влияющие на РГА многочисленны. Основные из них приводятся ниже.

Штампы вирусов. Гемагглютинирующая активность штаммов вирусов неодинакова. У одних серотипов энтеровирусов все штаммы способны агглютинировать эритроциты, тогда как у других серотипов того же вируса не все штаммы обладают этим свойством. Каждый из гемагглютинирующих вирусов способен агглютинироватъ эритроциты животных только определенных видов и в определенном диапазоне температуры и рН среды, что иногда используется при дифференциальной диагностике. Так, эритроциты лошади и кошки агглютинируются вирусом классической чумы птиц и не агглютинируются вирусом Ньюкаслской болезни; владивостокские штаммы вируса Сендай, в отличие от японских штаммов, не агглютинируют эритроциты овцы при температуре 22°С и 37°С, а лишь при 4°С; вирус западного американского энцефаломие-

лита лошадей агглютинирует гусиные эритроциты при рН 6.,0...б,2, тогда как вирус Западного Нила — при рН 6,8.

Клетка-хозяин. Известно, что в ряде случаев способность вируса агглютинировать эритроциты зависит от хозяина, в кото­ром он размножался. Этот эффект может не зависеть от титра ви­руса или образования ингибиторов гемагглютинации, хотя оче­видно, что определенную роль могут играть и эти факторы.

К числу других факторов, которые влияют на гемагглютинацию, относятся доза вируса, используемая при заражении жи­вотного, куриного эмбриона или культуры клеток, температура, при которой культуру инкубируют, метод заражения и др.

Видовая принадлежность эритроцитов, используемых в РГА, имеет важное значение для реакции. Некоторые вирусы способны агглютинировать эритроциты животных многих видов. В тоже время известны вирусы, агглютинирующие эритроциты животных только одного какого-нибудь вида. В ряде случаев ви­русы вызывают агглютинацию эритроцитов животных только тех видов, которые чувствительны к заражению данным вирусом, или клетки которых можно заразить данным вирусом in vitro. В дру­гих случаях такую корреляцию обнаружить не удается. Обычно вирусы, относящиеся к одной классификационной группе, спо­собны агглютинировать эритроциты животных, принадлежащих к одному и тому же виду. По вполне понятным причинам в РГА наиболее широко используют эритроциты домашних птиц и млекопитающих.

Возраст донора. Возраст донора, от которого получают эритроциты, в значительной степени влияет на их агглютинацию. Например, вирусы оспы значительно интенсивнее агглютинируют эритроциты взрослых кур, чем только что вылупившихся цыплят, а для многих арбовирусов и вирусов бешенства характерна обратная зависимость.

Индивидуальные особенности доноров. Известно, что один из факторов, определяющих пригодность эритроцитов животного данного вида для РГА — это индивидуальные различия в чувст­вительности эритроцитов к вирусу.

Среди других факторов, влияющих на способность эритроцитов агглютинироваться вирусами, можно отметить пол животного донора.

Факторы окружающей среды, влияющие на РГА. Сильное влияние на агглютинацию эритроцитов вирусами оказывает тем­пература. Одни вирусы агглютинируют эритроциты лучше всего или только при 4 °С, другие — при 37 °С, третьи — одинаково хорошо при любой температуре, хотя по соображениям удобства РГА обычно ставят при комнатной температуре (от 20 до 25 °С). Следует отметить, что пока еще не было обнаружено ни одного вируса который агглютинировал бы эритроциты при этих темпе­ратурах лучше, чем при 4 °С или при 37 °С. Способность вируса агглютинировать эритроциты, в особен­ности в тех случаях, когда она слаба, как например, у арбовиру­сов, зависит также и от концентрации водородных ионов. Так, например, некоторые арбовирусы разрушаются при значениях рН, соответствующих оптимуму для вызываемой ими гемагглю­тинации. Вирус необходимо разбавлять раствором, рН которого отвечает условиям его стабильности, а затем доводить рН смеси до значения, оптимального для гемагглютинации, используя соот­ветствующий разбавитель. У некоторых вирусов способность агглютинировать эритро­циты зависят от наличия или отсутствия в среде некоторых ио­нов, например, Са2+, Nа+, Mg2+. Иногда присутствие вирусных гемагглютининов маскирует­ся наличием в системе ингибиторов сложного состава, поступаю­щих из клеток, в которых размножался вирус. Перед постановкой РГА эти ингибиторы удаляют путем прогревания, обработки аце­тоном, эфиром, фторуглеродными соединениями, трипсином, рецепторразрушающим ферментом и высокоскоростным центрифу­гированием. Ингибиторы чаще встречаются в препаратах вирусов, полученных из тканей интактных животных, чем из культур кле­ток.

Компоненты реакции: исследуемый вируссодержащий ма­териал (носоглоточные смывы, аллантоисная и амниотическая жидкости, содержимое кожных высыпаний и т. п.); 0,5%...1%-ная взвесь эритроцитов; фосфатно-буферный (физиологический) рас­твор.

Схема постановки. РГА ставят в пластиковых панелях с равномерно округлым гладким дном. Вначале готовят 2-кратные последовательные разведения вируссодержащего материала (от 1:2 до 1:320 и выше). С этой целью в ряд лунок приливают 0,1 мл физраствора. Затем в 1-ю лунку добавляют 0,1 мл исследуемого вируссодержащего материала, перемешивают и 0,1 мл смеси переносят во 2-ю лунку и т. д. Из последней лунки 0,1 мл выливают в дезинфицирующий раствор. Во все лунки добавляют по 0,1…1%-ной взвеси отмытых эритроцитов. Одновременно ставят контроль

эритроцитов для исключения возможности спонтанной гемагглютинации. Для этого к 0,1 мл физиологического раствора добавляют 0,1 мл 0,5...1%-ной взвеси эритроцитов. Панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30...60 мин (табл.6).

Рис.1 Агглютинация эритроцитов кур вирусом гриппа.

а — титрование вируса: I, II, III — интенсивная агглютинация, обозначаемая тремя и двумя плюсами; IV — слабая агглютинация, обозначаемая одним плюсом; V — отсутствие агглютинации, обозначаемое знаком минус, б — резкая задержка агглютинации.

Таблица 6

Схема постановки реакции гемагглютинации (РГА)

Компоненты реакции	Номера лунок										Конт роль
1	2	3	4	5	6	7	8
Физ раст - вор	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Вирусосодержащий материал	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	В дезраст вор
Получа-ые разведения	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256
1% взвесь эритро-тов	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Экспозиция при комнатной температуре 30…60 мин
результаты	+++	+++	++	++	+	-	-	-	-

Учет и оценка результатов реакции. РГА учитывают визуально по форме образовавшегося осадка эритроцитов — гемагглютината.

При резко положительной РГА ("+++") образуется рыхлый осадок (зонтик) на дне и стенках лунки; "++" — осадок только и дне лунки; "+" — наличие незначительной агглютинации эритроцитов на дне лунки; "-" — эритроциты оседают на дне лунки виде точки с ровными краями (отрицательная).

Гемагглютинирущий титр вируса — это наибольшее разведение (наименьшее количество вируса), при котором наблюдаете; гемагглютинация не менее чем на "++". Это разведение соответствует одной гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ, см. табл.6). В таком же объеме исследуемого (без разведения) материала таких единиц (доз) вируса будет больше во столько раз, во сколько раз пришлось развести материал, чтобы получить 1 ГАЕ. Так, если высшим разведением, еще дающим гемагглютинацию, оцениваемую на "++", будет 1:16 (табл.6), это значит, что в объеме титрования вируса, разведенного в 16 раз, содержится 1 ГАЕ, а в такси же объеме титруемого материала таких единиц будет 16, т. е. титр вируса в данном материале равен 16 ГАЕ. Поскольку суспензию эритроцитов и вируссодержащий материал в разведениях берут в равных объемах, то безразлично, на какой объем будет приходиться 16 ГАЕ, ибо с возрастанием объема одного компонента во столько же раз увеличивается и объем другого. Поэтому соотношение количеств эритроцитов и вирионов смеси вируссодержащего материала с суспензией эритроцитов при изменении их объемов не изменяется, значит, не изменяется и число ГАЕ.

Феномен гемагглютинации довольно часто используют для очистки вирусов. Многие из них адсорбируются на эритроцитах при 4 °С, а элюируются при 37 °С и, наоборот. Вирусную суспен­зию смешивают с эритроцитами при температуре, оптимальной для адсорбции, затем агглютинат центрифугируют и промывают. В дальнейшем изменяют температуру и вирус элюируется с по­верхности эритроцитов. В результате получают суспензию вируса, относительно свободную от сопутствующего материала.

Гемадсорбция — соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, инфицированных гемагглютинирующим вирусом, адсорбируются эритроциты, чувствительные к нему. Так, например, на клетках, инфицированных вирусом парагриппа-3, адсорбируются эритроциты морской свинки, вирусом гриппа — эритроциты кур и т. д.

Реакцию гемадсорбции целесообразно ставить с целью обна­ружения (до проявления или при слабо выраженном ЦПД) в ин­фицированной культуре клеток вируса, обладающего гемагглюти­нирующей способностью.

Компонентами реакции служат культура клеток в пробирках в норме и инфицированная, а также 0,4%-ная взвесь эритроцитов, приготовленная на физиологическом растворе или растворе Хенкса.

Методика реакции состоит в следующем. Из пробирок с культурой клеток, инфицированных и неинфицированных (контроль), удаляют питательную среду (можно без удаления) и вносят 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов, способных агтлютинироваться предполагаемым вирусом. Затем штатив с пробирками встряхи­вают и оставляют в наклонном положении полосой вверх, при комнатной температуре или помещают в холодильник, длитель­ность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубации и вида вируса. Так, гемадсорбция с респираторными вирусами при комнатной температуре наступает через 3...5 мин, а при 4 °С —через 30...50 мин.

Учет реакции гемадсорбции проводят при малом увеличени­ем микроскопа после непродолжительного покачивания или вра­щения пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эрит­роциты прочно фиксируются на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного про­мывания. На клетках, пораженных вирусом, эрит­роциты адсорбируются в виде островков или диффузно (островковый и диффузный тип адсорбции). При от­рицательной реакции адсорб­ция эритроцитов на культуре клеток не наступает, и они свободно плавают в поле зре­ния микроскопа.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомиться с компонентами РГА и гемадсорбции. 2. Поставить и учесть результат РГА. 3. Поставить и учесть результаты положительной и отрица­тельной реакции гемадсорбции под микроскопом.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация компонентов РГА и гемадсорбции. 4. Самостоятельная работа студентов. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Время занятия целесообразно распределить следующим образом: вначале самостоятельная работа студентов по постановке РГА. При выполнении данной работы группу делят на подгруппы в зависимости от наличия на кафедре материальных средств. Для постановки РГА целесообразно использовать вирус Ньюкаслской болезни (аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, заражен­ные этим вирусом на занятии по куриным эмбрионам). В крайнем случае можно использовать суспензию вирусвакцины против Ньюкаслской болезни (более отчетливые результаты в РГА дает штамм Н).

Затем следует объяснение преподавателя. После объяснения студенты по подгруппам ставят реакцию гемадсорбции и произво­дят учет РГА и реакции гемадсорбции. Переписывание схемы по­становки РГА студентами способствует лучшему ее осмыслению и запоминанию.

Вопросы домашнего задания

1. Возбудитель лейкоза кур и КРС. 2. Сущность РЗГА и задержки гемадсорбции.

ЗАНЯТИЕ 15. Реакция задержки (торможения) гемагглютинации (РЗГА, РТГА) и задержки гемадсорбции (РЗГАд)

Цель занятия: изучить сущность, технику постановки РЗГА (РТГА) и РЗГАд.

Оборудование и материалы: вирус ньюкаслской болезни с известным титром, определенным на предыдущем занятии, сыво­ротка крови кролика, иммунизированного вирусом Ньюкаслской болезни, физиологический раствор, 0,4...1%-ная суспензия эрит­роцитов кур, пластиковые панели с лунками, пипеточные дозато­ры, пипетки градуированные на 1 мл, резиновые груши, аппарат Киппа, культура клеток, инфицированная вирусом, клеточный монослой в норме, таблицы по теме.

Краткие теоретические сведения

Серологические (serum — сыворотка крови) реакции при изучении вирусов и диагностике вирусных инфекций приобрета­ют все большее значение. В связи с достигнутыми в последние годы успехами в приготовлении высокоочищенных антигенов, иммунных сывороток, совершенствовании самой техники поста­новки серологических реакций повысилась их специфичность и чувствительность. Вскоре после открытия РГА было установлено, что противовирусные сыворотки, соединенные с соответствующим вирусом, способны нейтрализовать его гемагглютинирующую ак­тивность, т. е. задерживать процесс гемагглютинации. Одной из простейших серологических реакций является реакция задержки (РЗГА) или торможения (РТГА) гемагглютинации.

РЗГА (РТГА) — высокоспецифическая серологическая реак­ция, позволяющая решить следующие задачи: определить титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифи­цировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известней сыворотке; установить степень антигенного родства двух гемагглютинирующих вирусов. РЗГА широко используют для ретро­спективной диагностики некоторых вирусных инфекций (грипп, парагрипп КРС, вирусный аборт овец и др.). Для этого использу­ют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 2...3 недели, и по приросту титра антител в 4 и более раз определяют заболева­ние.

Достоинства РЗГА: простота техники постановки, быстрота ответа, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевиз­на. Недостаток — РЗГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Сущность РЗГА заключается в том, что при взаимодействии противовирусной иммунной сыворотки с соответствующими штаммами вируса происходит задержка (торможение) гемагглютинирующей способности вируса. На результат РЗГА влияют неспецифические ингибиторы гемагглютинации, содержащиеся в сыворотках крови. Они обла­дают способностью вступать в связь с вирусами и тормозить гемагглютинацию. С целью ликвидации отрицательного влияния ингибиторов на ход реакции их необходимо разрушить (удалить). Для этого используют несколько методов.