При учете результатов РН по этому варианту пользуются Е методом определения индекса нейтрализации по Риду и Менчу. Индекс нейтрализации представляет собой отношение дозы вируса в смеси с нормальной сывороткой, вызывающей изменения у 50% чувствительных объектов, к дозе вируса, вызывающей те же изменения в смеси с иммунной сывороткой. Или, другими словами, это число, показывающее, во сколько раз специфическая сыворотка снижает титр вируса по сравнению с нормальной. В нашем примере (табл.11):
ИН = Т 1/ Т 2 = 107 / 102 = 105
где Т1 — титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Tg — титр вируса в присутствии специфической сыворотки.
Индекс нейтрализации до 10 указывает на отсутствие вируснейтрализующих антител в сыворотке, от 11 до 49 считается сомнительным, а 50 и выше — положительным.
В настоящее время существуют различные модификации проведения РН. Приведем некоторые из них.
Микрометод РН. Применяется при диагностике везикулярного стоматита, гриппа, парагриппа, аденовирусных инфекций. При данном методе используют пластмассовые пластины, в лунках которых выращивают соответствующую культуру клеток (ПЭС, ФЭК, СПЭВ, ТБ). Затем в лунки вносят двукратные разведения испытуемой сыворотки, соединенные с суспензией вируса в концентрации 100 ТКИД50 (тканевая инфицирующая доза) и через 4...7 суток инкубации оценивают выраженность цитопатического действия вирусов. Данный метод позволяет значительно снизить расходы исследуемых сывороток и вирусного диагностического материала, одновременно исследовать большое количество образцов сывороток.
Цветная проба. Суть этой реакции заключается в способности вируса подавлять обменные процессы в зараженных клетках культуры ткани. Клеточные суспензии с определенной концентрацией клеток добавляют в пробирку или в лунки пластмассовых пластин через час после внесения в них смеси вируса с определенными разведениями сыворотки. Цветная проба основана на том, что клетки, размножаясь в незараженных пробирках или пробирках со смесью вируса и нейтрализовавших его антител, образуют много кислых продуктов обмена, которые снижают рН питательной среды. Это легко обнаруживают благодаря включенному в состав среды индикаторному красителю (например, феноловому красному), цвет которого меняется в зависимости от рН среды. Красный цвет при рН 7,4.-7,8 становится оранжевым при рН 7,2, а при снижении рН ниже 7,0 — желтым. При гибели клеток под воздействием вируса не наблюдается выделения достаточного количества кислых продуктов, поэтому среда остается красной. Титр вируснейтрализующих антител определяют как последнее разведение сыворотки, которое в присутствии добавленного вируса позволило клеткам сохранить нормальные обменные процессы, а следовательно, и снизить рН среди до того же уровня, что и в незараженной контрольной культуре. Обычно цветную пробу широко используют при работе с энтеро - и аденовирусами животных, а также вирусами птиц (болезни Ньюкасла, инфекционного бурсита, инфекционного синовита сухожилий, болезни Марека, инфекционного бронхита птиц, герпеса индеек).
Метод супернейтрализации. Данный метод используется для более точного количественного выявления содержащихся в сыворотках антител. Он основан на повторном добавлении индикаторного вируса, использованного при первоначальной постановке РН, ко всем пробам сывороток, нейтрализовавшим вирус на первом этапе. В результате вновь возникает реакция взаимодействия между вирусом и избыточным количеством антител. В пробах с более низким содержанием антител эта нейтрализация не происходит или будет частичной, в результате чего проявится ЦПД вируса на клетки. В пробах с избытком антител ЦПД будет вновь отсутствовать из-за полной нейтрализации вируса этими антителами.
В ходе самостоятельной работы студентов необходимо
1. Оценить результаты РН в культуре клеток и рассчитать индекс нейтрализации.
Примерный план занятия (2 ч)
1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Подведение итогов занятия.
4. Задание к следующему занятию.
Методические указания
На одном занятии всю РН поставить невозможно, имеет смысл использовать изготовленный набор с фиксированными спиртом культурами клеток (нормальных и с ЦПД), набранных так, что образуется реакция нейтрализации. Для этого предварительно выращивают в пробирках (не менее 50) культуры клеток любого типа и примерно в половине из них заменяют питательную среду на 70%-ный этиловый спирт (2...3 мл на пробирку), предварительно отмыв монослой физиологическим раствором. Такие фиксированные культуры клеток хорошо сохраняются на горизонтальных (с уклоном 5°) штативах при комнатной температуре многие месяцы, оставаясь удобными для просмотра и мало отличаясь по виду от живых. Вторую половину пробирок с культурами клеток заражают вирусом, способным вызвать в них ЦПД. После образования ЦПД эти культуры также фиксируют в спирте. Подбирая затем комбинации пробирок с ЦПД и без него по группам, соответствующим предполагаемым разведениям сыворотки, составляют набор с произвольной схемой РН, снабдив пробирки номерами. На одну учебную группу необходимо иметь четыре таких набора, имитирующих РН. Студенты, кроме практического знакомства с РН, приобретают дополнительные навыки в оценке действия вирусов на культуры клеток.
ЗАНЯТИЕ 18. Реакции иммунодиффузии (РИД)
Цель занятия: изучить сущность и технику постановки реакций иммунодиффузии.
Оборудование и материалы: вируссодержащий материал (антигены для РИД), специфическая преципитирующая диагностическая сыворотка (можно использовать специфический гамма-глобулин), исследуемые и нормальная сыворотки крови, контрольный (отрицательный) антиген, чувствительные тест-объекты, 1%-ный агаровый гель в чашках Петри, пастеровские пипетки, пробойники для вырезания лунок в агаре, эксикатор с влажной фильтровальной бумагой, стекла предметные обезжиренные, расплавленный агар в пробирках, дезинфицирующий раствор, таблицы по теме.
Краткие теоретические сведения.
Реакция иммунодифузии (РИД, синоним: реакция диффузией преципитации в агаровом геле) широко используется в лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, инфекционной анемии лошадей, болезни Ауески и др.
Сущность реакции заключается в том, что специфические антигены и антитела диффундируют в геле агара из мест локализации навстречу друг другу и, взаимодействуя, образуют полосы преципитации (комплекс: антиген + антитело), которые хорошо заметны на фоне прозрачного геля. Преципитат представляет собой барьер с селективными свойствами — в нем связываются только однотипные антигены и антитела, но он легко проницаем для других неродственных компонентов. Скорость диффузии антигена и антител при одинаковой плотности агара обратно пропорциональна размерам их молекул, т. е. чем меньше молекула антигена, тем быстрее он диффундирует в геле и наоборот. Вследствие различий в скорости диффузии отдельных антигенов, а также различного содержания их в исследуемом многокомпонентном растворе и специфических антител в иммунной сыворотке в агаре возникают многочисленные полосы преципитации, соответствующие отдельным системам антиген - антитело. РИД используют в двух вариантах: 1) для определения видовой принадлежности антигена; 2) для обнаружения специфических антител в исследуемой сыворотке крови. Кроме того, ее можно применять для спектрального анализа простых и ложных антигенных систем и установления количественного содержания антигена в разных субстратах, определения общего набора и количественного содержания антител в соответствующих иммунных сыворотках, получаемых в разное время от различных видов животных и человека, контроля за чистотой получаемых антигенных препаратов и диагностических сывороток; изучения антигенного родства между вирусами.
Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором — оба. В зависимости от того происходит ли диффузия по одной общей оси или во все стороны радиально, из резервуара в среду, иммунодиффузия называется линейной или радиальной.
В настоящее время используется ряд методов диффузионной преципитации: 1) метод простой диффузии в агаровый гель по Оудину; 2) метод двойной диффузии в агаровый гель (в пробирках) по Окли и Фулторпу; 3) метод двойной диффузии в агаровый гель (в капиллярах) по Вязову; 4) метод простой радиальной иммунодиффузии по Манчини; 5) метод двойной диффузии в агаровый гель по Оухтерлони.
Компонентами 1-го варианта реакции являются: вируссодержащий материал (исследуемый антиген), преципитирующая сыворотка, 1%-ный агаровый гель; 2-го варианта: исследуемая сыворотка крови, вирусный диагностикум и 1%-ный агаровый гель. Для контрольной реакции необходимы: нормальная сыворотка крови животного — продуцента преципитирующей сыворотки, контрольный антиген — экстракт ткани здорового животного того же вида, от которого получен вируссодержащий материал (ткань должна быть аналогична той, в которой локализуется вирус). Необходимым компонентом реакции иммунодиффузии является гелевая среда, приготовленная из агара. К агаровому гелю предъявляют следующие требования. Он должен быть прозрачным, достаточно плотным (обычно используют 1-1,5 или 2%-ный раствор агара), стерильным, рН должен быть в пределах 6,4...8,5. Чаще всего используют агар фирмы "Дифко", агар Noble, Ferrak или очищенную агарозу. Приготовление геля из очищенных агаров ("Дифко" и др.) несложно. В этом случае берут 1 весовую часть агара и добавляют к ней 99 весовых частей физиологического раствора (можно использовать забуференные или буферные растворы с рН 7,3—7,4), Колбочку со смесью ставят в кипящую водяную баню, растворяют агар и добавляют консервант (мертиолят натрия 1:10000). Затем смесь разливают по пробиркам и употребляют по мере надобности. (Используемые для РИД сухие неочищенные агары различных марок подвергают предварительной очистке. Берут одну часть его, заливают 30 частями дистиллированной воды, добавляют 0,5% хлористого кальция и кипятят до расплавления. Горячий агар-агар фильтруют через двойной слой марли и разливают тонким слоем в стеклянные сосуды с плоским дном. После застывания агаровый гель разрезают на мелкие кусочки (1х1 см),складывают в стеклянную банку, обвязывают сверху марлей и ставят под струю водопроводной воды на трое суток для промывания. Затем воду сливают через марлю. Промытый гель расплавляют в водяной бане, добавляют к нему равное количество 1,6%-ного раствора NaCI и мертиолят натрия 1:10000. Приготовленный таким образом агаровый гель разливают по колбочкам и до употребления хранят при температуре 4 °С. Рекомендуется хранить агар в больших объемах (по 30—60 мл), так как при повторном разогревании жидкость испаряется, изменяется концентрация агара, нарушаются его физико-химические свойства.)
РИД по Оухтерлони проводят в двух модификациях: макропреципитация в агаровом геле в чашках Петри и микропреципитация в агаровом геле на предметных стеклах. В последнее время макропреципитацию в чашках Петри применяют реже из-за необходимости большого количества компонентов. Микропреципитация протекает быстрее (расходуется меньше реагентов), технически она не сложнее макрометода и по чувствительности не уступает ему.
Макропреципитация в агаре в чашках Петри сводится к следующему. Расплавленный агаровый гель в количестве 25 мл наливают в чашки Петри. В остывшей агаровой пластине выштамповывают пробойником или стеклянной трубочкой отверстия (диаметр 4-7 мм и более, в зависимости от цели опыта). В последнем случае для того, чтобы лунки были расположены на равных расстояниях, под чашку необходимо подкладывать трафарет. Лунки должны отстоять друг от друга по меньшей мере на 3 мм, расстояние более 10 мм употребляется редко.
Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединенной с вакуумной установкой. Необходимо при этом избегать отслоения от стекла и повреждения агара.
При исследовании антигенов в центральную лунку левого шестиугольника (1-й вариант расположения лунок) пастеровской пипеткой наливают 2-3 капли преципитирующей сыворотки или специфического т-глобулина, в четыре периферийные — исследуемые антигены, в пятую — специфический антиген (контроль №1), в шестую — антиген из нормальной ткани (контроль №2). В центральную лунку правого шестиугольника наливают 2-3 капли нормальной сыворотки, а в остальные — исследуемые антигены, антиген из нормальной ткани, стандартный вирусный антиген (соответственно контроли №3-8). Компоненты РИД вносят с таким расчетом, чтобы у верхнего края образовался несколько вогнутый мениск и жидкость не растекалась по поверхности агара.
После заполнения лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру при температурах, 4 °С, 18...25°, 37...38 °С на 24—72 ч (в зависимости от вида вируса). Реакцию оценивают визуально в косопроходящем или отраженно-рассеяном свете, начиная с контрольной. В нашем примере полосы преципитации наблюдают в контроле 1, в контролях №2-8 их не должно быть. Если исследуемые антигены (левый шестиугольник) специфичны антителам преципитирующей сыворотки, то между центральной лункой и первыми четырьмя лунками периферии образуются полосы преципитации (рис.).
При определении антител постановка реакции методически осуществляется аналогично, лишь с той разницей, что в центральную лунку левого шестиугольника наливают стандартный антиген, а в четыре периферические — исследуемые сыворотки, в пятую — стандартную преципитирующую сыворотку (контроль № 1), в шестую — нормальную сыворотку (контроль № 2). В центральную лунку правого шестиугольника вносят контрольный антиген, а в периферические — исследуемые сыворотки, положительную и нормальную сыворотки (контроль № 3-8). Вначале учитывают результат контрольной реакции. В нашем примере полосу преципитации наблюдают в контроле № 1, в контролях же № 2-8 их не отмечают. Если в исследуемых сыворотках содержатся преци-литины, соответствующие антигену, между центральной лункой и первыми четырьмя лунками, расположенными по периферии, наблюдают полосы преципитации.
Для микропреципитации в агаре на предметных стеклах необходимы чистые, тщательно обезжиренные предметные стекла. Их помещают на горизонтальную поверхность (стол). Слегка подогретой пипеткой (40...45°) набирают нужное количество (3—4 мл) расплавленного (50...60°) 1%-ного агарового геля и выливают на поверхность стекла. Толщина слоя агара при этом должна быть 1...1.5 мм. После застывания агара на поверхности каждого стекла стандартными штампами выдавливают лунки, из которых затем отсасывают агар. Размеры и форма штампа могут быть различными, в зависимости от цели опыта. Затем в лунки пастеровскими пипетками с тонко оттянутыми концами или микропипетками наливают антигены и антисыворотки (аналогично макрометоду). После заполнения луночек реагентами стекла помещают во влажную камеру (чашка Петри с фильтровальной бумагой, смоченной водой; эксикатор с герметически закрывающейся крышкой и др.) и оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат (37 °С).
Предварительный учет результатов РИД производят через 8...10 ч, основной — через 24 ч и окончательный — через 48...72 ч.
При оптимальном соотношении антигенов (АГ) и антител (AT) после окончания диффузии линия преципитации располагается примерно на середине расстояния между лунками, перпендикулярно к оси, соединяющих центра. Если один из компонентов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим содержанием реагента. При достаточно высокой концентрации компонентов реакции она может достигать соседнего сектора агаровой пластинки, в котором формируются полосы преципитации другой антигенной системы. Характер расположения полос определяет степень родства антигенов. Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации.
1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов.
2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реагирующие с AT детерминанты АГ неидентичны и, следовательно, сами антигены различны.
3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой "шпоры". "Шпора" часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с АГ сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими AT иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из АГ имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих AT в антисыворотке приводит к образованию "шпоры".
4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это значит, что оба антигена содержат как одинаковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспецифической сыворотки.
Рис. Расположение линий преципитации при сравнительных исследованиях методам двойной радиальной иммунодиффузии:
В ходе самостоятельной работы студентов необходимо
1. Оценить результаты РН в культуре клеток и рассчитать индекс нейтрализации. 2. Залить расплавленный агар на предметные стекла. 3. Изготовить лунки в слое агара. 4. Разлить по лункам компоненты РИД. 5. Зарисовать схемы РИД в рабочую тетрадь.
Примерный план занятия (2 ч)
1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация залива агара на предметные стекла; изготовления лунок; внесения компонентов РИД в лунки. 4. Самостоятельная работа. 5. Учет результатов РИД и их внесение в схему РИД производится на следующий день или на следующем занятии. 6. Подведение итогов занятия. 7. Задание к следующему занятию.
Методические указания
В целях экономии времени при постановке РИД студентам необходимо дать чашки Петри с уже разлитым в них агаровым гелем. В качестве компонентов реакции необходимо использовать диагностические наборы, выпускаемые биопромышленностью для постановки РИД при диагностике респираторно-синцитиальной инфекции, инфекционного ринотрахеита или аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, инфекционного бронхита кур и др. Антигены и сыворотки хранят в сухом темном помещении при температуре от +4 до 10 °С и используют по мере надобности согласно прилагаемым инструкциям, с учетом срока хранения.
Вопросы домашнего задания
1.Вирусы болезни Тешена и гастроэнтерита свиней. 2.Сущность РСК.
ЗАНЯТИЕ 19. Реакция связывания комплемента (РСК)
Цель занятия: изучить особенности и технику постановки РСК.
Оборудование и материалы: исследуемые сыворотки, стандартный вирусный диагностикум (антиген), диагностические сыворотки (иммунные специфические сыворотки), гемолизин, комплемент, 2,5%-ная взвесь эритроцитов барана, штативы, пробирки, пипетки на 1,2 и 5 мл, термостат, таблицы по теме.
Краткие теоретические сведения
Реакция связывания комплемента (РСК) — один из наиболее ценных методов, имеющихся в распоряжении вирусолога. По чувствительности эта реакция уступает реакциям нейтрализации, торможения гемагглютинации или методу флуоресцирующих антител, однако она обладает и рядом преимуществ. Во-первых, она намного проще. Во-вторых, при помощи реакции связывания комплемента можно выявить некоторые вирусные антигены, не обладающие инфекционностью или гемагглютинирующей активностью, например так называемые «растворимые» антигены миксовирусов, капсиды энтеровирусов, а также «неоантигены», образуемые некоторыми онкогенными вирусами.
Обнаружение комплементсвязывающих антител — один из наиболее ценных методов диагностики вирусных инфекций. Дело в том, что комплементсвязывающие антигены многих вирусов обладают групповой специфичностью. Так, например, растворимые антигены различных штаммов вирусов гриппа А и В обладают групповой, а не штаммовой специфичностью. Аденовирусы также содержат групповой комплементсвязывающий антиген. Комплементсвязывающие антигены групповой специфичности образуют и некоторые арбовирусы.
Очевидно, что групповая специфичность вирусных антигенов исключает возможность использования этого теста для более детальной диагностики — установления типовой принадлежности вируса. Тем не менее РСК является очень ценным методом массовой диагностики, так как в подобных случаях в первую очередь требуется установить групповую принадлежность вируса. При желании тип вируса можно затем установить с помощью более специфичных серологических методов.
При естественных заболеваниях, вызываемых некоторыми другими вирусами, например коксаки или ECHO, также образуются гетерологичные антитела, однако это явление наблюдается не столь регулярно, чтобы на его основе можно было идентифицировать групповую принадлежность вируса. Поэтому в случае заболеваний, вызываемых этими агентами, диагностическая ценность РСК невелика.
Особую ценность представляет РСК для изучения антигенных взаимосвязей между вирусами.
Реакция связывания комплемента (РСК) широко используется в диагностической практике для обнаружения специфических комплементсвязывающих антител в исследуемых сыворотках крови и для определения вида или типа вируса. Ее применяют для диагностики многих вирусных инфекций (ящура, энцефаломиелита лошадей и др.).
Сущность реакции состоит в том, что здесь участвуют две системы: специфическая (исследуемая сыворотка + антиген) и индикаторная (гемолитическая сыворотка или гемолизин + взвесь эритроцитов барана). Связующим компонентом между ними является комплемент. В зависимости от того, где он адсорбируется, наблюдают тот или иной исход реакции. Если комплемент используется в специфической системе — реакция положительная, индикаторной — отрицательная. Положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза (эритроциты находятся во взвеси — жидкость мутная, красного цвета), отрицательная — полным гемолизом (лизис эритроцитов — жидкость прозрачная, красного цвета.
Компоненты реакции следующие: исследуемая сыворотка крови (исследуемый антиген), стандартный вирусный антиген (стандартная сыворотка), гемолитическая сыворотка или гемолизин, эритроциты барана, комплемент. В качестве разбавителя используют изотонический раствор хлорида натрия (рН 7,2... 7,4) или различные буферные растворы.
Рис. Реакция связывания комплемента: а — положительная (задержка гемолиза); б — отрицательная (гемолиз)
Постановка РСК при вирусных инфекциях значительно отличается от постановки ее при бактериальных инфекциях. Это обусловлено рядом специфических свойств вирусов.
1. Для освобождения вирусного антигена приходится обрабатывать инфекционный материал с целью извлечения его из клетки.
2. Вирусные антигены не отличаются высокой устойчивостью, поэтому материал для их получения берут от павших животных в первые часы гибели, а лучше при жизни. Консервирование вируссодержащего материала часто не дает положительных результатов, так как многие из них вызывают разрушение вирусного антигена.
3. Неравномерность фиксации комплемента при различном соотношении концентраций антиген-антитело. Комплекс антиген + антитело образуется только при строгих количественных соотношениях этих компонентов. При избытке антител фиксация комплемента резко снижается. То же наблюдают и при избытке антигена, где подавление фиксации происходит еще быстрее. Поэтому для установления оптимальной дозы комплемента необходимо предварительное титрование антигена и антитела.
4. Незначительный объем комплекса антиген-антитело. Размер вирусных частиц, вступающих в этот комплекс, а следовательно, и площадь фиксации комплемента небольшие. С увеличением объема комплекса антиген-антитело путем удлинения периода фиксации компонента повышается чувствительность реакции, но снижается ее специфичность, так как увеличивается фиксация комплемента неспецифическими тканевыми антигенами.
5. Высокая комплементарная активность вирусных антигенов. В своем составе они содержат тканевые антигены, что мешает проведению реакции (неспецифическая фиксация комплемента). Для исключения этого явления необходима более полная очистка вирусных антигенов от тканевых фрагментов.
Кроме того, существенной помехой для РСК при диагностике вирусных заболеваний животных и человека является неравномерное накопление антигена и антител в различные периоды болезни и особенно при разных инфекциях. Поэтому постановка РСК должна иметь особенности не только в зависимости от характера заболевания, но и от ее цели (обнаружение антигена, антител, титрование вируса и т. д.).
Для повышения чувствительности РСК требуется некоторое изменение методики ее постановки — связывание комплемента в РСК при вирусных инфекциях проводят длительно (18...20 ч) и на холоде (О...4 °С). В этих условиях антиген и антитело успевают прореагировать наиболее полно, что повышает чувствительность реакции. Однако, несмотря на трудности постановки РСК, эта реакция нашла применение для обнаружения вируса в исследуемом материале. Типичным примером может служить постановка РСК для обнаружения вируса ящура, определения его типа и варианта,
Антигены и предъявляемые к ним требования: 1) достаточно высокая антигенная активность; 2) отсутствие примесей антигенов организма хозяина; 3) отсутствие компонентов, обладающих антикомплементарной активностью; 4) безопасность в отношении распространения инфекции и безвредности для работающего персонала; 5) хорошая сохраняемость при разных температурных режимах; 6) стандартность антигена.
Приготовление антигенов. Инфекционный материал освобождают от грубых тканевых частиц, измельчают ножницами и растирают в ступке с кварцевым песком, разбавляют буферным раствором и центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают и подвергают дальнейшей обработке. Эта обработка преследует следующие цели: максимальное освобождение вируса из клеток, удаление клеточных материалов и разрушение прокомплементарной активности. Вирусные материалы для антигенов берут из органов и тканей естественно или экспериментально зараженных животных с учетом тропизма вирусов и сроков вирусовыделения. Антигены можно получать из зараженных куриных эмбрионов и культуры клеток с учетом стадии репродукции вируса и особенностей его накопления в клетках или внеклеточно в питательной среде. Однако, в любом случае в препаратах антигенов относительно много материала клеток хозяина. Такой материал потенциально способен взаимодействовать с антителами. Поэтому всегда необходимо ставить контрольную реакцию с антигеном, полученным из аналогичной незараженной ткани. Таким образом определяют наличие в препарате антигенов клеток хозяина. Их количество можно уменьшить, очистив препарат с помощью центрифугирования в градиенте плотности, хроматографией на колонке или путем воздействия фторуглеродных соединений или органических растворителей (ацетон, эфир, хлороформ). Некоторые антигены обладают антикомплементарной активностью, т. е. способны сами по себе связывать или разрушать те или иные компоненты комплемента. Удалять материал, обладающий антикомплементарной активностью, рекомендуется с помощью фторуглеродистых соединений или обрабатывая его прогретым комплементом морской свинки.
Приготовление сывороток. Для получения сывороток, содержащих комплементсвязывающие антитела, лабораторных животных подвергают либо иммунизации по определенным схемам, либо заражению инфекционным агентом. Введению активного вируса предшествуют две-три инъекции формалинизированной суспензии. После получения сыворотки титруют (определяют количество антител), а затем лиофилизируют или консервируют. Лиофильно высушенные сыворотки можно хранить в условиях холодильника до 4-х лет. Для консервирования сывороток наиболее удобным и общедоступным средством является фенол. Готовят 5%-ный раствор фенола на физрастворе и добавляют в сыворотки из расчета 1:9. Добавление проводят по каплям при постоянном перемешивании. Фенолизированные сыворотки фасуют по ампулам и хранят в условиях холодильника в течение года. Все сыворотки, используемые в РСК, перед опытом обязательно инактивируют в течение 30 мин: сыворотки морской свинки и кролика при 56 °С, крыс — при 60 °С, собак — 65 °С, мышей — 60 °С, крупного рогатого скота — 56...58 °С, лошадей и овец—58-60 °С.
Сыворотки, как и антигены, тоже обладают антикомплементарностью, т. е. способностью связывать комплемент в отсутствие антигена и тем самым задерживать гемолиз. Она может быть обусловлена как длительным хранением сывороток, так и свойством, присущим некоторым животных (например, кроликам). Поэтому сыворотки нужно хранить в состоянии глубокой заморозки или лиофильно высушенными. Кроме того, следует тщательно отделять сыворотку от сгустка, не захватывая эритроцитов. Для устранения антикомплементарности их прогревают при температуре на 1—2 °С выше необходимой для инактивации комплемента, или замораживют при минус (20...70) °С с последующим удалением осадка центрифугированием. Хорошие результаты дает обработка сывороток углекислотой (см. РЗГА) или комплементом морской свинки. Для этого к 3-м объемам сыворотки добавляют 1 объем комплемента морской свинки, смесь инкубируют в течение ночи при 4 °С, а затем 30 мин при 37 °С. После этого сыворотку разбавляют 1:4 или 1:8 буферным раствором и инактивируют при 60 °С в течение 30 мин.
Эритроциты. Обычно при постановке реакции применяют эритроциты барана. Их получение описано в занятии 12. Для длительного хранения в последнее время широко используют раствор Альсевера. При смешивании 2 частей крови и 1 части этого раствора эритроциты сохраняются при 4 °С в течение 4—6 недель.
Раствор Альсевера готовят по следующей прописи: декстрозы — 20,5 г, цитрата натрия — 8,0 г, лимонной кислоты — 0,55 г, хлористого натрия — 4,2 г, дистиллированной воды — до 100 мл; рН раствора 6,1. Раствор автоклавируют при 0,06 МГГа в течение 10 мин или пропускают через фильтр Миллипор и другие с размером пор 0,22 мкм.
Комплемент выпускают биофабрики в лиофилизированном виде. Но его можно получить в любой лаборатории. Для этого у морских свинок из сердца берут кровь, помещают ее в термостат на 30 мин, сгусток отделяют стерильной спицей и выдерживают ночь в холодильнике. Затем сыворотку собирают пастеровской пипеткой и консервируют, добавляя к 10 мл ее 0,2 г борной кислоты и 0,3 г сернокислого натрия. Комплемент сохраняется до 2-х недель в холодильнике в замороженном состоянии. Его титруют каждый раз в день постановки главного опыта.
Гемолизин — сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана, Гемолизин выпускают биофабрики в сухом виде.
Обнаружение и идентификация вируса ящура в РСК. РСК по 100%-ному гемолизу применяют для определения типов и вариантов вируса ящура. РСК ставят в различных объемах: если общий объем 1 мл — каждый компонент берут в объеме 0,2 мл; общий объем 0,5 мл — каждый компонент берут в объеме 0,1 мл.
Для приготовление антигена стенки афт от больных животных отмывают от консервирующей жидкости физраствором, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательно растирают в ступке с песком, добавляют двойное по отношению к массе афт количество физраствора. Полученную суспензию экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, замораживают до минус (10...20) "С в течение 5...18 ч. После размораживания центрифугируют. Надосадочную жидкость инактивируют 40 мин при 58 °С и используют в качестве антигена РСК.
Методика постановки РСК следующая
1. Титрование гемолизина. Гемолизин титруют при получении его новой серии. Выпускае
мый биофабриками гемолизин часто консервирован глицерином (1:1). Вначале готовят основное разведение 1:100. Для этого берут 0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физраствора. Из него готовят разведение 1:1000-к 1 мл гемолизина 1:100 добавляют 9 мл физ раствора. Из основного раствора (1:1000) готовят все последующие по указанной ниже схеме (табл.12). Получив необходимые разведения гемолизина, проводят его титрование (табл. 13).
Табл.12
Схема приготовления разведении гемолизина
Компоненты, мл | Разведения | |||||||
1:1500 | 1:2000 | 1:3000 | 1:4000 | 1:5000 | 1:6000 | 1:7000 | 1:8000 | |
Гемозолин 1:1000 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1.0 | 1,0 | 1,0 | 1.0 |
Физраствор | 0,5 | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 7,0 |
Таблица 13
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
