Учебно – методические материалы по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по курсу вирусологии (стр. 3 )

Одновременно ставят следующие контроли:

1) контроль культуры клеток в норме (ростовую среду ме­няют на поддерживающую);

2) контроль диагностического (известного) вируса (клеточ­ный монослой + вирус);

3) контроль нормальной сыворотки (клеточный моно­слой + нормальная сыворотка).

Учет РЗГад проводят под малым увеличением микроскопа. При положительной реакции эритроциты свободно плавают в по­ле зрения. Это обусловлено тем, что гемадсорбирую -

щая способ­ность вируса нейтрализована антителами специфической сыво­ротки. При отрицательной реакции происходит адсорбция эритроцитов на поверхности клеток

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомиться с компонентами РЗГА и реакции задержки гемадсорбции.

2. Поставить и учесть результат РЗГА. 3. Просмотреть в микроскопе пробирки с положительным и отрицательным результатами реакции задержки гемадсорбции.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация компонентов РЗГА и задержки гемадсорб­ции, техники постановки и учета результатов этих реакций.

4. Самостоятельная работа студентов: учет реакции по про­верке правильности выбора 4ГАЕ; удаление ингибиторов из ис­следуемых сывороток с помощью СС>2; постановка РЗГА для обна­ружения антител; постановка РЗГад; учет РЗГА и РЗГад. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Наиболее сложным и ответственным моментом является приготовление рабочей дозы вируса (4 ГАЕ) и подготовка сыворо­ток крови. Очень важно, чтобы сыворотка надежно работала с ви­русом. Самым доступным и полностью отвечающим назначению является вирус Ньюкаслской болезни (штамм Н) и специфическая сыворотка к нему (из диагностического набора). Специфическую сыворотку к вирусу Ньюкаслской болезни в большом количестве можно получить на кроликах путем их гипериммунизации.

Освобождение сывороток от ингибиторов имеет смысл про­вести демонстрационно для всей группы. При выполнении данной работы группу делят на подгруппы в зависимости от наличия на кафедре материальных средств.

Вопросы домашнего задания

Вирусы гриппа и парагриппа КРС. 2. В чем отличие непрямой гемагглютинации от прямой? 3. Принцип РНГА. 4.Постановка и учет РНГА.

ЗАНЯТИЕ 16. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Цель занятия: изучить компоненты, их подготов­ку, схему постановки и учета РНГА.

Оборудование и материалы: микротитратор системы Такачи или другой, растворитель для компонентов и постановки самой реакции, резиновая груша, эритроцитарный диагностикум, иссле­дуемые и контрольные сыворотки, пипеточные дозаторы, пипетки на 1 мл, физиологический раствор, забуференный физраствор рН 7,2, эритроциты быка или барана, танин, акролеин или фор­мальдегид, хлористый хром, останавливающий раствор; дистил­лированная вода, таблицы по теме.

Краткие теоретические сведения

Реакция непрямой гемагглютинации позволяет ре­шить следующие диагностические задачи:1) обнаружить антитела и определить их титр в исследуе­мых сыворотках крови;

2) обнаружить и идентифицировать неизвестный вирусный антиген.

Сущность реакции в том, что эритроциты, на кото­рых предварительно адсорбированы антигены или антитела, спо­собны агглютинироваться в присутствии гомологичных антител или антигенов. Эритроциты выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых про­исходит в результате реакции антиген-антитело. Регистрируют данную реакцию по характеру образовавшегося осадка эритроци­тов, т. о., она является сугубо специфической серологической. Необходимо отметить, что РНГА отличается от РГА. В РГА эритроциты агглютинируются с рецепторами вирусов за счет сво­их комплементарных рецепторов. В РНГА агглютинация проис­ходит за счет образования комплексов антиген + антитело (рис.). Если к поверхности эритроцитов присоединить анти­гены, получают антигенный эритроцитарный диагностикум, способный в исследуемой сыво­ротке определять антитела. И, наобо­рот, эритроциты, сенсибилизирован­ные антителами, на­зывают антительным эритроцитарным диагностику-

мом и применяют для быстрого об­наружения антигенов в различных субстратах.

Достоинства РНГА. Эта реакция обладает высокой чувствительностью, превосходя РИД, РСК и приближа­ясь к иммуноферментному анализу, отличается простотой техни­ки постановки и быстротой ответа (2...3 ч). Недостаток — опреде­ленные трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов.

Компоненты реакции. Для определения антител в иссле­дуемых сыворотках необходимо иметь: а) антигенный эритроцитарный диагностикум; б) исследуемую сыворотку крови; в) разбавитель (в нем ставится реакция). Для определения антигенов в исследуемых биологических жидкостях необходимо иметь: а) антительный эритроцитатный диагностикум; б) исследуемый биологический субстрат; в) разбавитель.

Постановка РНГА включает следующие основные этапы:

а) приготовление растворов и подготовка исследуемых жидкостей;

б) получение эритроцитарных диагностикумов;

в) постановка главного опыта РНГА.

Обычно в лабораториях ставят только главный опыт, а остальные процедуры проводят на предприятиях биологической промышленности.

Подготовка растворов и исследуемых жидкостей. Физио­логический раствор, забуференный физраствор (рН 7,2), разбави­тель готовят на дистиллированной воде. Физраствор готовят по общепринятой методике. Для приготовления забуференного физ-раствора с рН 7,2 к 1 л последнего добавляют 0,49 г КНаР04 и 1,62 г Na2HP04, стерилизуют

кипячением, охлаждают и исполь­зуют в работе. Этот раствор применяют для отмывания эритроци­тов, акролеинизации и танизации их. Разбавитель готовят, добавляя к физраствору 0,3% фенола и 1% нормальной лошадиной сыворотки. Его используют для раз­ведения исследуемых сывороток или других жидкостей, а также для хранения эритроцитарного диагностикума. Нормальную ло­шадиную сыворотку, исследуемые сыворотки и другие жидкости абсорбируют эритроцитами с целью освобождения от неспецифи­ческих гемагглютининов. С этой целью к одному объему прове­ряемой биологической жидкости прибавляют 0,1 объема осадка отмытых эритроцитов, пробирку со смесью встряхивают и выдер­живают при 37 °С в течение 30 мин, затем центрифугируют, из­влекают надосадочную жидкость и используют в работе.

Приготовление сенсибилизированных эритроцитов вклю­чает:

а) получение эритроцитов. Для этого используют кровь бара­на, крыс, человека. Кровь, полученную из яремной вены, дефибринируют с бусами в течение 20...30 мин и трехкрат­но отмывают забуференным физраствором. Затем их стабилизируют, подвергают танизации и сенсибилизации. В настоящее время чаще применяют эритроциты птиц — кур, индеек, уток. Приготов­ленные из них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет со­кратить сроки исследования без потери чувствительности;

б) стабилизация эритроцитов. Преимущество стабилизиро­ванных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для стабилизации эритроцитов предложено много методов. Чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Приводим один из методов. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 10%-ную взвесь на забуференном физрастворе рН 7,2. Одновременно готовят 0,2%-ный раствор акролеина на этом же растворителе. Соединяют их в равных объемах и ставят в водяную баню при 37 °С на 30 мин. После стабилизации эритроциты трижды отмывают забуференным физраствором и ресуспендируют в этом же растворе до 10%-ной концентрации, разливают по пробиркам и хранят при 2...4 °С. Срок хранения — 1 год;

в) танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты изучен слабо. Но при этом достигается главное — танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбционной емкостью. Фармакопейный танин должен обладать хорошей раствори­мостью в воде. Хранят его в прохладном сухом месте в сосуде, обернутом в черную бумагу. Раствор танина готовят непосредст­венно перед опытом. Для этого берут навеску 0,25 г порошкооб­разного танина и растворяют в 50 мл забуференного физраствора рН 7,2. Получают разведение 1:200, которое является основным и сохраняется на холоде при 2...4 °С в течение месяца. Из основного разведения готовят рабочее (1:20000). К 5%-ной взвеси акролеинизированных эритроцитов на за­буференном физрастворе добавляют равный объем раствора тани­на в разведении 1:20000. Смесь выдерживают в водяной бане 20...30 мин при 37 °С. В дальнейшем производят отмывание физ­раствором 2-3 раза и осадок ресуспендируют в физрастворе до 50%-ной концентрации. Хранят танизированные эритроциты при температуре 2...4 °С. Контроль на их самоагглютинацию ставят через 18...20 ч после приготовления. Для этого в лунке панели смешивают кап­лю полученной 2%-ной суспензии танизированных эритроцитов и каплю разбавителя. Через два часа эритроциты должны осесть на дно лунки в виде компактной точки. В случае незначительной агглютинации танизированных эритроцитов (+ или ++) суспензию необходимо дополнительно выдержать при 2...4 °С в течение 2...3 суток, после чего повторяют контроль. Если эритроциты и в этом случае оседают в виде "зонтика", то их считают непригод­ными и готовят заново.

г) Сенсибилизация эритроцитов. Для этого используют ан­тисыворотки или антигены. К 0,2 мл 50%-ной суспензии акро­леинизированных танизированных эритроцитов на физрастворе добавляют 0,2 мл раствора антигена или антител (концентрация по белку 2 мг/мл) и 0,6 мл физраствора. К данной смеси приливают по каплям 1 мл 0,1%-ного рас­твора хрома хлорида и оставляют при комнатной температуре не более, чем на 5 мин. Реакцию останавливают прибавлением 20...50 объемов 0,02 М фосфатно-буферного раствора рН 7,2, для приготовления которого берут 50 мл фосфатного буфера и 325 мл дистиллированной воды. Затем трижды отмывают этим же буфером и хранят в рабочей концентрации (2%-ная взвесь в разбавителе). Для конъюгации можно использовать и другие конъюгирующие агенты (глютаровый альдегид, риванол, ализариновый синий).

Полученные таким образом сенсибилизированные эритроци­ты используют в РНГА.

Основной опыт РНГА. Реакцию ставят в лунках пластмас­совых панелей. В последнее время применяют микрометод с по­мощью прибора Такачи. Исследуемые и контрольные сы­воротки прогревают 30 мин при 56 °С. Исследуемые сыворотки крови разводят разбавителем от 1:2 до 1:256. К каждому разведению добавляют каплю эритроцитарного диагностикума. Смесь компонентов встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2...3 ч, но не раньше полного осаждения эритроцитов в контроле (табл.9).

Одновременно ставят контроли: 1) заведомо положительная сыворотка ++++ эритроцитарный диагностикум; 2) заведомо отрицательная сыворотка + эритроцитарный ди­агностикум; 3) разбавитель + эритроцитарный диагностикум;

4) учет реакции. Реакцию учитывают по 4-х бальной систе­ме и выражают в плюсах в зависимости от интенсивности агглю­тинации:

Таблица 9

Основной опыт РНГА (для определения антител)

Компо­ненты	Номера лунок	Контроли
11	22	33	44	55	66	77	сыво­ротка +	сыво­рот­ка -	разбавитель
Разбавител	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1			0,1
Исследуе­мая сыво­ротка	00,1	00,1	00,1	00,1	00,1	00,1	00,1	0,1 в дезраствор	0,1
разведения	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Эритроци-тарный диагно-стикум	00,1	00,1	00,1	00,1	00,1	00,1	00,1	0,1	0,1	0,1
Экспозиция 2...3 ч при комнатной температуре
Учет ре­зультатов	++++	++++	++++	+++	+++	++	+	++++	-	-

Титр антител — 1:64

++++ — хорошо выраженный "зонтик" с загибающимися краями;

+++ — "зонтик" с ровными краями;

++ — "зонтик" со слабо выраженным кольцом по краю;

+ — отчетливо выраженное кольцо на фоне слабо выражен­ного "зонтика";

- — на дне лунки компактная точка эритроцитов. За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее раз­ведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не ниже, чем на ++. В нашем примере (табл.9) титр антител оставляет 1:64.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Подготовить микропанели, петли и пипетки для РНГА.

2. Поставить РНГА и провести её учёт с целью определения титра антител в сыворотке.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация наборов диагностикумов, выпускаемых биологической промышленностью, методики постановки РНГА микрометодом.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Желательно, чтобы студенты ставили РНГА микрометодом, в качестве компонентов использовать наборы, выпускаемые для этой цели биологической промышленностью. При отсутствии воз­можности можно ставить РНГА макрометодом с использованием пластмассовых панелей с лунками.

Вопросы домашнего задания

1. Вирусы инфекционного ринотрахеита и диареи крупногорогатого скота.

2. Сущность, схема постановки и учет реакции нейтрализа­ции.

3. Сущность, схема постановки и учет реакции иммунодиффузии.

ЗАНЯТИЕ 17. Реакции нейтрализации (РН).

Цель занятия: изучить сущность и технику постановки ре­акций нейтрализации.

Оборудование и материалы: вируссодержащий материал (антигены для РН и РИД), специфическая преципитирующая ди­агностическая сыворотка (можно использовать специфический гамма-глобулин), исследуемые и нормальная сыворотки крови, контрольный (отрицательный) антиген, чувствительные тест-объекты, 1%-ный агаровый гель в чашках Петри, пастеровские пипетки, пробойники для вырезания лунок в агаре, перья учени­ческие с ручками, эксикатор с влажной фильтровальной бумагой, стекла предметные обезжиренные, расплавленный агар в пробир­ках, зафиксированные культуры клеток на покровных стеклах (нормальные и с ЦПД), микроскопы с осветителями и приспособ­лениями для исследования пробирок с культурой клеток, дезин­фицирующий раствор, таблицы по теме.

Краткие теоретические сведения

Реакция нейтрализации широко используется в вирусоло­гической практике. Она предназначена для идентификации выде­ленного вируса, определения наличия антител и изменения их титра в сыворотке крови больных и переболевших животных, ус­тановления количественного содержания антител в лечебных, профилактических и диагностических препаратах (гамма-глобулины, диагностические сыворотки).

Сущность реакции нейтрализации заключается в способно­сти вируснейтрализующих антител иммунных сывороток подав­лять инфекционные свойства вируса. В результате этого вирус утрачивает способность размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения в чувствительной к нему биологической системе (культура клеток, развирающийся куриный эмбрион, организм восприимчивого лабораторного животного).

Достоинствами реакции нейтрализация являются ее универ­сальность и высокая специфичность. К недостаткам относятся: высокая трудоемкость, необходимость строгого соблюдения сте­рильности материалов и инструментов, высокая стоимость тест-объектов, необходимость проведения математических расчетов, относительная длительность при постановке реакции. На результаты РН, особенно на их достоверность и воспро­изводимость, оказывают влияние ряд факторов: методика поста­новки реакции, способ и правильность ее учета, концентрация используемых сывороток и вирусов, метод разведения компонен­тов реакции и др. Вируснейтрализующие антитела накапливаются в организме в период выздоровления (реконвалесценции) и остаются в нем длительное время. Оптимальные сроки для обнаружения антител в каждом случае различны и зависят от особенностей иммунитета при той или иной инфекции. Например, при гриппе свиней мак­симальный титр вируснейтрализующих антител регистрируется между 14 и 27-м днями и снижается к 6 месяцам. При лейкозе птиц антитела выявляются спустя 4 недели после заражения и сохраняются в течение всей жизни.

Сыворотки, применяемые в РН, должны быть предвари­тельно освобождены от термолабильных ингибиторов. Для этого их прогревают при разведении не менее чем в два раза в течение 30 мин при 56 °С. Однако, антитела к некоторым вирусам (парагриппа, респираторно-синцитиальной инфекции) чувствительны к прогреванию, поэтому при постановке РН с такими сыворотками его следует избегать.

При хранении сывороток титр антител постепенно снижает­ся. Долго хранившиеся сыворотки активизируют добавлением к ним 1/10 объема комплемента, увеличивающего авидность анти­тел. Вируснейтрализующие антитела хорошо сохраняются в лиофильно высушенном или замороженном состоянии (-20 °С).

Для разведения вирусов при постановке РН на лаборатор­ных животных или в куриных эмбрионах используют фосфатно-буферный раствор (рН 7,0... 7,2). При работе с культурами клеток используют ту среду, которую применяют в качестве поддержи­вающей для данного вида клеток (среда 199, 2,5...5%-ный гемогидролизат и др.). Не следует применять раствор обычного изотонического хлорида натрия, поскольку в нем быстро инактивируются многие вирусы.

В зависимости от цели исследования применяют два вариан­та постановки РН: 1 — для идентификации и определения титра вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови (в данном случае соединяют равные объемы разных разведения сыворотки с постоянной дозой вируса); 2 — для идентификации и изучения неизвестного вируса (соединяют равные количества одного и того же разведения сыворотки с убывающими дозами ви­руса). Результаты реакции как в первом, так и во втором вариан­тах определяют о использованием лабораторных животных, РКЭ и культур клеток.

Компонентами реакции в 1-м варианте постановки РН являются: исследуемая сыворотка, стандартный вирусный анти­ген, тест-объект, для контрольной реакции — диагностическая и нормальная сыворотки крови. Реакцию ставят в два этапа: пер­вый этап — определение титра вируса; второй — постановка ос­новного опыта РН в этом варианте.

Для определения титра вируса готовят 10-кратные разве­дения вируссодержащего материала, обычно с 10-1 до 10-9, так как его титр редко превышает указанную величину. Берут 9 сте­рильных пробирок и в каждую из них вносят по 4,5 мл фосфатно-буферного раствора. Затем в первую добавляют 0,5 мл вируссодержащего материала (разведение 1:10 или 10-1), смесь перемешивают и 0,5 мл переносят во вторую пробирку (разведение 1:100 или 10-2). Из второй — 0,5 мл — в третья (10-3) и т. д., пользуясь при этом всякий раз чистой пипеткой. Каждым разведением ви­руссодержащего материала заражают лабораторных животных (4 гол.). Объем вводимого материала зависит от метода зараже­ния, который связывают с тропизмом вируса. Например, при за­ражении нейротропным вирусом исследуемый материал вводят в мозг, пневмотропным — через нос, дерматропным — на скарифи­цированную кожу или внутрикожно и т. д. За животными наблю­дают в течение 3...30 дней и более, в зависимости от возраста и вида животного и др. факторов. Наибольшее разведение вируса, обеспечивающее гибель половины (50%) зараженных животных, принимают за титр вируса, обозначаемого в данном случае симво­лом ЛД50 (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Допустим, вирус в разведении 104 вызвал гибель 50% животных, это разведение и будет соответствовать 1 ЛД5о. Следовательно, 100 ЛД50 будет соответствовать разведению 102 (1:100). Это разведение чаще всего используют.

Аналогично определяют титр вируса на РКЭ по их гибели (ЭЛД50 — эмбриональная летальная доза) или по патологоанатомическим изменениям (ЭИД50 — эмбрионинфицирующая доза) в культуре клеток по цитопатическому действию (1 ТЦД50 — тка­невая цитопатическая доза).

Постановка реакции. После установления титра вируса го­товят двукратные разведения исследуемой сыворотки, начиная с 1:2 до 1:128 и более, в зависимости от предполагаемого титра ви­руснейтрализующих антител, в объеме 0,5 мл и к каждому разве­дению сыворотки добавляют по 0,5 мл вируссодержащего мате­риала в разведении, соответствующем 100 ЛД5о - Одновременно ставят контроли:

а) контроль вируса (100 ЛД50 вируссодержащего материала соединяют с физиологическим раствором в равных объемах);

б) контроль иммунной сыворотки (иммунную сыворотку в рабочем титре соединяют с вируссодержащим материалом в равных объемах);

в) контроль нормальной сыворотки (нормальную сыворотку соединяют с 100 ЛД5о вируса в равных объемах),

Пробирки встряхивают и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 30...60 мин. Смесью из каждой пробирки, в том числе и из контрольных, заражают чувствительных лабораторных животных (4 гол.). Идентификацию вируснейтрализующих анти­тел с применением данного тестобъекта проводят при диагности­ке ящура, бешенства, лейкоза птиц. Объем и место введения сме­си те же, что были выбраны при определении 1 ЛД5о - Сроки наблюдения за животными аналогичны вышеуказанным.

Учет результатов. Вначале учитывают результаты контро­лей. В первом и третьем из них животные должны погибнуть, во втором— остаться в живых. Если исследуемая сыворотка содер­жит антитела, то они будут нейтрализовать патогенное действие вируса и животное не погибает. Однако, сыворотку используют в разведениях, и, в связи с этим, в определенной пробирке антител окажется недостаточно для нейтрализации вируса. Процент гибе­ли животных будет нарастать в направлении большего разведе­ния. Все это дает возможность определить титр вируснейтрали­зующих антител, который рассчитывается по методам Рида и Менча или Кербера. За титр антител исследуемой сыворотки при­нимают то разведение, которое предотвращает гибель 50% лабо­раторных животных от действия 100 ЛД5о вируса (табл.10). При использовании РКЭ результат РН учитывают по спо­собности вируснейтрализующих антител сыворотки предотвра­щать гибель эмбрионов, появление фокусов поражения на хорионаллантоисе и снижать титр вирусных гемагглютининов у 50% куриных эмбрионов. Эти методы применимы при определении ней­трализующей активности сывороток по отношению к вирусам гриппа, оспы, болезни Ньюкасла, инфекционного ларинготрахеита и бронхита кур.