Гипергомоцистеинемия как значимый фактор риска развития артериальных и венозных тромбозов в Северо-Западном регионе России

(РосНИИ Гематологии и трансфузиологии, г. С.-Петербург)

Гипергомоцистеинемия как значимый фактор риска развития артериальных и венозных тромбозов в Северо-Западном регионе России.

PREVALENCE OF HYPERHOMOCYSTEINEMIA IN PATIENTS WITH ARTERIAL AND VENOUS THROMBOSIS FROM NORTH WESTERN RUSSIA.

Hyperhomocyst(e)inemia (HHcy) can result from genetic and/or nutrient-related disturbances in homocysteine metabolism. A common C677T substitution in the gene coding for metylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) creates a thermolabile enzyme with reduced activity that may predispose to HHcy. HHcy is an established risk factor for arterial and venous thrombosis in the general population. At the same time there are conflicting results on the role of the C677T common mutation as a risk factor for thromboses. The aim of our study was to evaluate the significance of HHcy and MTHFR genotype in venous and/or arterial thrombosis in the population of North-Western Russia. In this study we also evaluated haemostatic parameters in our patients and their changes after folic acid supplements. 84 patients and 30 controls were included in the study. When evaluating the prevalence of HHcy among patients we found it to be very prominent. HHcy was detected in 35% of patients with deep venous thrombosis, 25% of patients with arterial thrombosis, 64% of patients with both arterial and venous thrombosis and 38% of patients with peripheral arterial occlusive disease vs. 10% in the control group. The mean plasma Hcy levels in the patient groups were significantly higher than in the control group. We postulate, that mild-to-moderate HHcy is associated with an increased risk of both arterial and venous thrombosis in our patients. We found a strong correlation between moderate HHcy and the MTHFR TT genotype and demonstrated this as a risk factor for arterial and venous thrombosis. We also report significant association between high caffeine consumption and heavy smoking and HHcy. When evaluating haemostatic parameters in our patients we found more pronounced alterations in HHcy subjects. Statistically significant differences were detected for factor VIII activity and VWF level and activity. When detecting Hcy levels after folic acid supplements we found them to be significantly reduced. Among haemostatic parameters statistically significant changes after supplementation were observed only for the ATIII activity.

Key words: – thrombosis, hyperhomocysteinemia, homocysteine

Введение

Гипергомоцистеинемия (ГГЦ) развивается в результате нарушенного метаболизма гомоцистеина (ГЦ) и является фактором риска развития тромбозов и атеросклероза [2,8,12,23]. ГЦ является промежуточным продуктом обмена метионина в организме и в нормальных условиях метаболизируется в ходе двух основных реакций: реметилирования с участием ферментов метилентетрагидрофолатредуктазы (МТГФР) и метионин-синтетазы, витамина В12 как ко-фактора и 5-метилтетра-гидрофолата как донора метильной группы; и сульфурирования при участии фермента цистатионин-синтетазы в присутствии витамина В6. Основными причинами развития ГГЦ являются генетические дефекты, приводящие к неполноценности вышеуказанных ферментов, а также снижение уровня витаминов-кофакторов, необходимых для метаболизма гомоцистеина, что в свою очередь может быть следствием пищевого дефицита, использования некоторых лекарственных препаратов или результатом ряда заболеваний [11, 13, 14],. Наиболее часто встречающейся в популяции мутацией, ведущей к развитию ГГЦ, является замена С677Т в гене МТГФР. Эта мутация ведет к появлению термолабильного фермента со значительно сниженной функциональной активностью (до 30% от нормального уровня при гомозиготном и до 65% при гетерозиготном носительстве) [17]. На основе большого числа экспериментальных работ сформировалось представление о повреждающем действии избытка ГЦ на эндотелий сосудов, выражающемся в угнетении его антикоагулянтных и стимуляции прокоагулянтных свойств. Однако механизмы тромбогенного и атерогенного действия ГГЦ окончательно не ясны [16, 22, 24]. Также при несомненно доказанном влиянии уровня витаминов и фолата в организме на развитие ГГЦ остается открытым вопрос о роли терапии фолиевой кислотой и витаминами В6 и В12 в профилактике тромбообразования [11].

В данной работе мы ставили перед собой следующие цели:1) определить является ли ГГЦ существенным фактором риска развития тромбоза в нашей популяции; 2) проанализировать влияние генотипа фермента МТГФР на уровень ГЦ плазмы у обследуемых; 3) изучить особенности нарушений гемостаза у больных с ГГЦ; 4) оценить эффект терапии фолиевой кислотой на уровень ГЦ и показатели гемостаза.

Объекты и методы исследования

Обследована группа из 84 больных (48 мужчин и 36 женщин) в возрасте от 17 до 65 лет в период с февраля по ноябрь 2000 года. Критерием отбора больных в исследуемую группу являлось наличие в анамнезе объективно доказанного артериального и/или венозного тромбоза либо диагностированного в возрасте до 50 лет облитерирующего атеросклероза сосудов нижних конечностей (ОАНК). В группу артериальных тромбозов (АТ) вошли 20 больных (7 с острым инфарктом миокарда и 13 – с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу). Группу венозных тромбозов (ВТ) составили 40 пациентов с наличием венозного тромбоза в анамнезе. У 11 больных отмечались и артериальные, и венозные тромбозы (АВТ группа). 13 больных проходили лечение в хирургической клинике по поводу тяжелой хронической артериальной недостаточности нижних конечностей на фоне прогрессирующего атеросклеротического процесса. В последних двух группах подавляющее большинство составляли мужчины. Средний возраст больных на момент обследования был 41,3± 10,7 лет, 41,3± 13 лет, 47,0± 13,2 лет и 52,4± 7,1 лет в группах больных с АТ, ВТ, АВТ и ОАНК соответственно. В контрольную группу вошли 30 человек (в возрасте от 16 до 65 лет) без атеротромботических проявлений в анамнезе.

Уровень ГЦ определяли методом HPLC в Гемофильном Центре больницы Святого Томаса (Лондон). Исследование показателей гемостаза проводилось в <Российской – ред.> лаборатории свертывания крови. Коагулологические тесты проводились с использованием реактивов фирмы Ренам и Stago и включали в себя определение АПТВ, протромбинового индекса, тромбинового времени, концентрации фибриногена, активности фактора VIII и антитромбина III. У всех больных определялось содержание фактора Виллебранда в плазме и ристоцетин-кофакторная активность фактора Виллебранда [3]. Состояние внутрисосудистой активации тромбоцитов исследовано с помощью морфофункционального метода [5]. Антифосфолипидные антитела волчаночного типа выявлялись с использованием высоко чувствительных реактивов фирмы Stago. Молекулярно-генетические исследования (определение мутации С677Т гена МТГФР, А506G гена фактора V (Leiden) и G20210A в гене протромбина) проводились методом ПЦР [1]. Пациенты, у которых были выявлены мутации фактора V Leiden, протромбина и/или волчаночный антикоагулянт, не включались в статистическую обработку данных.

Статистический анализ проводился при помощи пакета Stat Pad Prism (версия 2) в среде Windows. Дополнительный риск (OR) и 95% доверительные интервалы (CI) были использованы для установления степени риска развития тромбоза. Дополнительный риск рассматривался как статистически значимый при нижней границе доверительного интервала > 1,0. Распространенность ГГЦ оценивалась с использованием непараметрического критерия Фишера, со значениями Р < 0,05 как статистически значимые. Для выявления влияния МТГФР генотипа на уровень ГЦ использован анализ one-way ANOVA. При сравнении средних величин использовался непарный t тест.

Результаты и обсуждение

Во всех группах больных распространенность ГГЦ статистически значимо превысила таковую в контрольной группе. ГГЦ выявлена у 14 больных с венозными тромбозами (35%), 5 с артериальными тромбозами (25%), 7 больных с наличием и артериальных и венозных тромбозов в анамнезе (64%), 5 пациентов с ОАНК (38%). В контрольной группе ГГЦ была отмечена у 3 человек, что составило 10%. При этом средние уровни ГЦ у больных достоверно (р<0,05) превышали средний уровень в контрольной группе: 15.08± 1.08 мкмоль/л при венозных тромбозах, 15.26± 2.35 при артериальных тромбозах, 26.81± 6.71 при смешанных тромбозах и 14.47± 1.14 у больных с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей атеросклеротического генеза в сравнении с 11.07± 0.74 мкмоль/л у практически здоровых лиц. Весьма существенно, что самые высокие показатели уровня ГЦ плазмы были выявлены у клинически наиболее тяжелых больных с наличием в анамнезе нескольких тромботических эпизодов (как артериальных, так и венозных).

Средний уровень ГЦ был также достоверно выше у больных с повторными тромбозами по сравнению с пациентами с единичным тромботическим эпизодом - 20,97± 2,78 мкмоль/л и 14,18± 1,01 мкмоль/л соответственно. Было показано, что ГГЦ существенно увеличивает риск ретромбоза. По нашим данным из 31 пациента с повышенным уровнем ГЦ в плазме у 18 (т. е. в 58% наблюдений) отмечались повторные эпизоды тромбозов (артериальных и/или венозных), в то время как среди 53 больных без ГГЦ ретромбозы были у 12 человек, т. е. лишь в 23 % наблюдений. Таким образом, вероятность развития повторного тромбоза у лиц с ГГЦ в 4,7 раз выше, чем у лиц с нормальным уровнем ГЦ - OR=4,7 (95%CI: 1,81-12,37).

Принимая во внимание тот факт, что С677Т мутация гена МТГФР ведет к снижению энзиматической активности данного фермента и, следовательно, нарастанию уровня ГЦ в плазме, мы изначально предполагали выявить определенные закономерности между генотипом и уровнем ГЦ среди обследованных нами лиц. Это было тем более интересно, поскольку в странах Европы частота встречаемости Т аллеля гена МТГФР и средние значения уровня ГЦ различаются. Они существенно выше на Юге Европы и, постепенно понижаясь в Центральной Европе, достигают наименьших значений в Балтийском регионе. Причины этого могут заключаться как в различной частоте встречаемости С677Т полиморфизма в разных популяциях, так и в во взаимодействии генотипа с факторами окружающей среды (традиционная структура питания, экономические и социальные условия, некоторые особенности образа жизни). Последнее приводит к фенотипически различным проявлениям наследственной предрасположенности [11, 17]. В России подобных исследований не проводилось. Нам удалось показать влияние С677Т замены на уровень ГЦ в плазме в популяции Северо-Запада России. При этом у больных эффект С677Т мутации на уровень ГЦ в плазме прослеживался более отчетливо чем в контрольной группе (табл.1).

Таблица 1

Зависимость уровня ГЦ плазмы от С677Т полиморфизма гена МТГФР.

	Генотип
СС	СТ	ТТ
Контроль	Больные	Контроль	Больные	Контроль	Больные
Число наблюдений (n)	12	35	15	32	3	17
Уровень ГЦ M± m мкмоль/л	9.96± 0.6	13,21± 0,74*	11.01± 0.6	14,44± 0,79*	15.81± 6.4	27,65± 4,92*

* - достоверное различие между группами

Следует отметить, что средние показатели ГЦ в обследованной контрольной группе оказались очень близки к среднеевропейским показателям: 16,5 мкмоль/л для ТТ, 10,4 мкмоль/л для СТ мкмоль/л и 10,0 мкмоль/л для СС генотипа [20].

Из общего числа пациентов с ГГЦ (31) у 7 (22%) уровень ГЦ плазмы превышал 30 мкмоль/л и все они были гомозиготными носителями Т аллеля. Существенное и статистически значимое (р=0,005) нарастание уровня ГЦ в плазме отмечалось при сочетании ТТ генотипа с привычно высоким потреблением кофе и курением (табл.2).

Таблица 2

Влияние привычно высокого потребления кофе и курения на уровень гомоцистеина.

	ТТ генотип
	в сочетании с привычно высоким потреблением кофе и курением	в сочетании с одним из этих факторов	без этих факторов
Число наблюдений	7	6	4
Уровень ГЦ плазмы, M± m мкмоль/л	42,17± 8,75 *	21,04± 4,73 *	12,11± 1,02 *

* - достоверное различие между группами

Ранее нами было установлено, что частота встречаемости гомозиготного носительства Т аллеля (TT генотип) в Северо-Западном регионе России составляет 8.4%, гомозиготного носительства С аллеля (CC генотип) - 58% и 33.6% являются гетерозиготами (CT). Частота встречаемости Т аллеля и С аллеля составляет 25% и 75% соответственно. В Европе в среднем частота встречаемости мутантного аллеля составляет 32%, при этом в странах Балтийского региона она несколько ниже (23%) в сравнении с остальными регионами (37%) [17]. Следовательно, популяция Северо-Западного региона России по этому показателю ближе к странам Балтии. Результаты исследований, проведенных в различных популяциях и оценивающих прямое влияние С677Т замены в гене МТГФР на риск развития тромбозов крайне противоречивы [6, 9, 12, 19]. По нашим данным частота встречаемости Т аллеля во всех группах больных, за исключением больных с ОАНК, статистически значимо превышала таковую в популяции Северо-Западного региона (p < 0.05). В группе артериальных тромбозов она составила 45%, в группе венозных - 36% и в группе смешанных тромбозов - 45%. Таким образом, можно отметить, что носительство Т аллеля увеличивает риск развития венозного тромбоза в 1,7 раза (OR=1,70; 95% CI 1.03-2,80; p<0,005) а артериального тромбоза в 1,9 раза (OR=1,92; 95% CI 1.03-2,80; p<0,05). Более всего – в 2,5 раза - носительство данного аллеля увеличивает риск развития тяжелых патологических состояний, характеризующихся сочетанием артериальных и венозных тромбозов (OR=2.49; 95% CI 1.04-5.91; p<0,05). При этом следует особо подчеркнуть, что согласно нашим данным, ТТ генотип гена МТГФР увеличивает риск развития тромбоза (артериального и/или венозного) в 5,4 раза (OR=5,4 95%CI:1,72-17,47).

Принимая во внимание известные по литературным данным протромботические эффекты ГГЦ, представлялось интересным провести сравнительную оценку состояния гемостаза у больных с нормальным и с повышенным уровнями ГЦ в плазме.

Как показали наши исследования, обычные скрининговые показатели коагулограммы (АПТВ, протромбиновый индекс, тромбиновое время, уровень фибриногена) практически у всех больных были в пределах нормальных колебаний вне зависимости от уровня ГЦ. Активность антитромбина-III (АТIII) составила 107,8± 4,9 у больных с ГГЦ, а у больных без ГГЦ – 127,3± 4,5 по сравнению с 108,8± 0,5 в контрольной группе (р=0,02). Эти данные отразили тенденцию к активации системы естественных антикоагулянтов у больных с нормальным уровнем ГЦ в плазме. В то же время при повышенном уровне ГЦ подобного эффекта не отмечалось, что может быть результатом токсического воздействия избытка ГЦ на эндотелий, проявляющегося в частности снижением экспрессии гепаран-сульфата и следовательно, уровня АТIII [11, 24]. Общим для всех групп больных было достоверное увеличение по сравнению с нормой активности фактора VIII, активности и содержания фактора Виллебранда, а также числа активных форм тромбоцитов и количества тромбоцитов в агрегатах. При этом у всех пациентов с ГГЦ наблюдалась отчетливая тенденция к большей выраженности прокоагулянтных нарушений, а в группе смешанных тромбозов эти различия достигали статистической значимости по таким показателями как активность фактора VIII, активность и содержание фактора Виллебранда (табл.3).

Таблица 3

Отдельные показатели гемостаза у больных с ГГЦ и без ГГЦ (M± m).

Показатель Группы больных	Фактор VIII активность, %	VWF R:Co активность %	VWF Ag содержание %	Показатели ВАТ
Сумма активных форм тромбоцитов %	Число тромбоцитов в агрегатах %
Контрольная группа	100,3± 4,1	97,83± 5,51	98,3± 7,3	12,8± 0,5	6,8± 0,4
ВТ	ВТ больные с ГГЦ	162,6± 14,83*	159,5± 13,19*	169,2± 18,42*	25,79± 1,73*	9,9± 0,7*
ВТ больные без ГГЦ	156,0± 11,8*	138,0± 11,55*	140,1± 9,81*	22,73± 1,39*	8,38± 0,5*
AT	AT больные с ГГЦ	157,2± 15,65*	166,0± 16,39* , * *	175,0± 11,34*	20,0± 1,67*	7,8± 0,8*
AT больные без ГГЦ	140,6± 7,7*	102,0± 10,82* , * *	146,0± 15,14*	20,8± 1,89*	8,2± 0,7*
АТ+ВТ	АТ+ВТ больные с ГГЦ	250,4± 34,54* , * *	230,7± 17,2* , * *	230,4± 17,3* , * *	29,29± 2,9*	9,8± 1,1*
АТ+ВТ больные без ГГЦ	124,0± 7,17* , * *	123,0± 7,46* , * *	148,0± 33,56* , * *	24,75± 3,2*	8,0± 0,7*
ОАНК	Больные с ГГЦ	134,0± 15,91*	151,0± 17,58*	186,0± 22,6*	28,8± 5,9*	11,4± 2,2*
Больные без ГГЦ	150,0± 27,3*	162,1± 29,15*	176,3± 26,76*	20,5± 2,7*	7,8± 0,6*

* - р<0.001, достоверное различие с нормой

* * - р<0,05, достоверны различия между двумя группами больных

Полученные нами результаты являются клиническим подтверждением выдвигаемых рядом зарубежных авторов на основе экспериментов положений о токсическом влиянии избытка ГЦ на эндотелий сосудов. При этом высокую активность и содержание фактора Виллебранда у больных с ГГЦ можно рассматривать как маркер повреждения эндотелия [7, 8, 22]. Усиление внутрисосудистой активации тромбоцитов может быть следствием как прямого проагрегантного эффекта ГГЦ за счет усиления продукции тромбоксана А2 [15], так и результатом угнетения избытком ГЦ активности экто-АДФазы [10]и снижения синтеза в эндотелии простациклина и эндотелий-продуцируемого релаксирующего фактора [4, 25, 26].

В группу для повторного обследования после терапии фолиевой кислотой и витамином В6 были включены 30 человек с исходной концентрацией ГЦ плазмы >11 мкмоль/л (выше среднего уровня по нашей контрольной группе). Указанный уровень служил критерием отбора, ибо согласно европейским рекомендациям дополнительное введение в рацион фолиевой кислоты и витамина В6 в физиологических дозах следует начинать при концентрации ГЦ в плазме > 12 мкмоль/л (12 мкмоль/л – средний для западноевропейской популяции уровень по данным рандомизированного мультицентрового исследования) [21].

В указанной группе до начала витаминотерапии у 5 пациентов (17%) была выявлена ГГЦ средней степени (30-100 мкмоль/л), у 14 пациентов (47 %) - легкая ГГЦ (15-30 мкмоль/л), у 11 пациентов (36 %) уровень ГЦ плазмы был в пределах 11-15 мкмоль/л.

Больные с ГГЦ средней степени тяжести получали фолиевую кислоту в дозе 2 мг/день в течение 2-4 месяцев, а также витамины В6 и В12 в форме мультивитаминных добавок. Пациенты с легкой ГГЦ были повторно обследованы через 11-14 дней после начала витаминотерапии (фолиевая кислота 1-2 мг ежедневно и витамин В6 в инъекциях – 200 мг через день). У десяти пациентов с исходно нормальными, но превышающими 11 мкмоль/л значениями ГЦ плазмы, этот показатель был вновь оценен после 11-14 дней приема фолиевой кислоты в дозе 1-2 мг. Было установлено, что уровень ГЦ достоверно снизился у всех пациентов; в среднем - на 20-42 %. При этом снижение уровня ГЦ плазмы на фоне витаминотерапии как в абсолютных так и в относительных значениях было тем существеннее, чем выше был исходный уровень ГЦ (табл.4).

Таблица 4

Влияние витаминотерапии на уровень ГЦ в плазме (M± m).

	Уровень ГЦ	Степень снижения уровня ГЦ
До лечения	После лечения
Группа пациентов с уровнем ГЦ > 30 мкмоль/л	49,21± 8,24	28,34± 6,47	На 42%
Группа пациентов с уровнем ГЦ от 15 до 30 мкмоль/л	18,61± 1,045*	13,85± 1,11*	На 25%
Группа пациентов с уровнем ГЦ от 11 до 15 мкмоль/л	13,09± 0,29*	10,43± 0,86*	На 20%

* - достоверное различие между средним уровнем ГЦ до и после лечения

Принимая во внимание тот факт, что фермент МТГФР является ключевым ферментом фолатного цикла в организме, представлялось интересным рассмотреть эффективность лечения фолиевой кислотой в зависимости от С677Т полиморфизма. Оказалось, что у больных с ТТ генотипом уровень ГЦ снижался в среднем на 36%, в то время как у больных с СТ и СС генотипами на 25 и 23% соответственно.

При сравнительном анализе показателей гемостаза до и после терапии фолиевой кислотой удалось выявить одну интересную закономерность – у больных с ГГЦ достоверно повысился уровень АТIII (р< 0,0001 в парном тесте). Средние значения по уровню АТIII до лечения 118,5± 5,92 и 156,7± 9,26 после лечения также различались с очень высокой степенью достоверности (p=0.0014). Принимая во внимание возможность угнетения активности АТIII при ГГЦ, повышение уровня этого естественного антикоагулянта на фоне снижения уровня ГЦ можно считать закономерным. Статистически значимых изменений других показателей гемостаза выявить не удалось.

Заключение

В последние два десятилетия в зарубежной медицинской литературе огромное внимание уделяется различным аспектам ГГЦ, в то время как в России эта проблема только начинает изучаться. По полученным нами данным распространенность ГГЦ среди российских больных с артериальными, венозными, и, в особенности при сочетании артериальных и венозных тромбозов достаточно высока, и повышение уровня ГЦ плазмы существенно увеличивает вероятность развития тромбозов, а также способствует атеросклеротической трансформации сосудистой стенки. При этом риск повторного тромбообразования увеличивается в 4,7 раза. ТТ генотип гена МТГФР является важной детерминантой повышения уровня ГЦ плазмы, особенно в сочетании с низким содержанием в рационе фолата и некоторыми особенностями образа жизни, а именно - привычно высокое потребление кофе и курение. Носительство Т аллеля гена МТГФР является существенным наследственным фактором риска развития тромбозов и скрининговые исследования по выявлению этого достаточно распространенного в нашей популяции полиморфизма могут играть значимую роль в профилактике тромботических осложнений, особенно в группах высокого риска. Поскольку по результатам данной работы можно говорить о достаточно высокой распространенности тромбофилии на фоне ГГЦ среди больных с тромботическими осложнениями, мы считаем определение уровня ГЦ у больного с тромбозом и/или распространенным атеросклерозом целесообразным и необходимым в комплексном гемостазиологическом обследовании. Своевременная диагностика этой формы тромбофилии позволяет проводить ее адекватную терапию и вторичную профилактику с обязательным назначением фолиевой кислоты. Фолиевая кислота при назначении в дозах 1-2 мг/день курсом не менее 2-х недель эффективно снижает исходный уровень ГЦ. Наши данные подтверждают, что тромбогенный потенциал ГЦ связан с повреждением эндотелия и угнетением системы естественных антикоагулянтов, в частности АТIII. У больных с ГГЦ существенно выше уровень такого признанного маркера альтерации эндотелия как фактор Виллебранда, и не наблюдается (в отличие от больных без ГГЦ) активации АТIII в ответ на выраженную гиперкоагуляцию. Данные, полученные при сравнении показателей ВАТ у больных с нормальным и повышенным уровнем ГЦ, показывают, что при ГГЦ активация тромбоцитов усилена. Учитывая этот факт, при назначении антитромботических препаратов у больных с данной формой тромбофилии следует отдавать предпочтение препаратам низкомолекулярного гепарина (“Фраксипарин”, “Клексан” и т. п.), которые в меньшей степени, чем нефракционированный гепарин, способствуют агрегации тромбоцитов. Оценивая динамику показателей гемостаза у больных с повышенным уровнем ГЦ, можно также предположить, что им показаны пролонгированные курсы лечения низкомолекулярными гепаринами в сочетании с длительной витаминотерапией под квалифицированным клиническим и лабораторным контролем.

Автор признателен профессору за предоставленную возможность провести определение уровня ГЦ в руководимом им Гемофильном Референс Центре (Лондон).