Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота (стр. 2 )

2.2.2 Совершенствование методов диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных

2.2.2.1 Усовершенствование метода отбора биоматериала из пораженной конечности для лабораторного исследования

По данным экспертиз районных и областных ветеринарных лабораторий в большинстве случаев диагноз на некробактериоз не подтверждается. Одной из причин таких заключений лабораторий мы связываем с трудоемкостью взятия для бактериологического исследования некротизированных тканей из пораженного пальца внутри роговой капсулы. Второй причиной, на наш взгляд, является то, что некротизированные участки тканей для исследования отбираются с поверхности пораженного органа. На поверхности пораженных тканей органа присутствует, как известно, большое количество аэробных микроорганизмов. А возбудитель некробактериоза относится к анаэробным микроорганизмам и в пораженном органе находится глубоко, на границе здоровой и некротизированной тканей.

Для исследования в лабораторию направляют обычно пораженную фалангу по путовый сустав. Взятие из глубины пораженной фаланги некротизированных фрагментов тканей скальпелем, ножницами, пинцетом или ложкой Фолькмана, как правило, всегда очень затруднительно.

Мы предлагаем пораженную фалангу механически расчленить на несколько фрагментов (3-4), в зависимости от степени поражения. Затем в боксе из пораженных участков фаланги ложкой Фолькмана, скальпелем, ножницами или пинцетом, предварительно обработанных 70% спиртом или подвергнутых фломбированию над пламенем горелки, отбирают пробы некротизированных тканей для исследований. Дальнейшее бактериологическое исследование проводят согласно “Методическим указаниям по лабораторной диагностике некробактериоза” (1987).

При исследовании 15 пораженных конечностей диагноз на некробактериоз подтвердился при усовершенствованной методике отбора биологического материала для лабораторного исследования в 93,3 % случаев, а при обычной методе в 60%.

Таким образом, новый метод отбора биоматериала из пораженной конечности способствовал увеличению эффективности диагностики некробактериоза на 33,3% и может быть рекомендован для ветеринарных диагностических лабораторий.

2.2.2.2 Сравнительная эффективность индикации Fusobacterium necrophorum бактериологическим методом и с помощью гнездовой ПЦР

Исследования по разработке гнездовой ПЦР для диагностики некробактериоза проводили совместно с лабораторией генной инженерии (заведующий ). Нами проводилась индикация возбудителя некробактериоза и сопутствующей микрофлоры, накопление бактериальной массы, и взятие биологических образцов.

Первоначально проверена специфичность разрабатываемой диагностичес­кой тест-системы. Положительные анализы продуктов ПЦР получали только тогда, когда в качестве матрицы использовали ДНК патогенного возбудителя F. necrophorum subsp. necrophorum. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий: стафило­кокков, стрептококков, кишечной палочки, протея, микоплазмы.

Затем провели тестирование возбудителя некробактериоза в пробах, полученных от коров из разных хозяйств Кемеровской, Новосибирской областей и Алтайского края. Пробы были взяты от животных по клиническим показаниям.

Во всех случаях бактериологическое исследование биоматериала из пораженных конечностей (фаланга, костный мозг фаланги, кровь фаланги) при положительной биопробе на белых мышах совпадало с положительным результатом ПЦР, преимущественно с внутренним праймером (табл.1).

При исследовании абсцессов печени совпадение бактериологического исследования и ПЦР составило 50%.

Таблица 1 – Результаты сравнительных исследований биологических
образцов на некробактериоз

№ проб	Исследуемый материал	Бактериологическое исследование	ПЦР с праймерами
питательные среды и биопроба	получена чистая культура	наружные	внутренние
1	Фаланга 1	+	+	-	+
2	Фаланга 2	+	-	-	+
	3	Фаланга 3	+	-	-	+
	4	Фаланга 4	+	+	-	+
	5	Фаланга 5	+	+	-	+
	6	Фаланга 6	+	-	-	+
	7	Фаланга 7	+	-	-	+
	8	Фаланга 8	+	-	-	+
	9	Фаланга 9	+	+	-	+
	10	Фаланга 10	+	+	-	+
11	Костный мозг фаланги	+	+	+	+
	12	Кровь фаланги	+	-	-	+
13	Абсцесс печени 1	+	-	-	-
14	Абсцесс печени 2	+	-	-	-
15	Абсцесс печени 3	+	+	-	-
16	Абсцесс печени 4	+	-	-	+
17	Абсцесс печени 5	+	-	-	+
18	Абсцесс печени 6	+	+	-	+
	19	Абсцесс мышц	+	-	-	+
	20	Биоматериал от мыши	+	-	+	+
	21	Некротич. очаг от мыши	+	-	-	+
22	F. necroph. из коллекции	+	+	-	+
	23	F. necrophorum лиофилизиров. 1	+	н/и	-	+
	24	F. necrophorum лиофилизиров. 2	+	н/и	-	+
	25	F. necrophorum.	+	+	-	+

Примечание: “ + ” положительный результат,

“- ” отрицательный результат

Разработанная диагностическая тест-система полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять в биологических образцах патогенный биотип АВ F. necrophorum subsp. necrophorum.

Диагностическое исследование биологических образцов из пораженных конечностей на некробактериоз бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией тождественно.

ПЦР с гнездовыми праймерами для выявления F. necrophorum subsp. necrophorum может быть использована в качестве экспресс-метода для диагностики кожной формы некробактериоза.

2.2.3 Определение роли специфической профилактики в системе контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота.

2.2.3.1 Регламент получения антигена Fusobacterium necrophorum и
постановка реакции агглютинации

В настоящее время нет единого антигена для обнаружения антител против возбудителя некробактериоза F. necrophorum. Каждый исследователь готовит собственный антиген (АГ) для РА на основе полученных изолятов. В доступной отечественной литературе мы не встретили работ, сообщающих о методике изготовления антигена F. necrophorum для РА, утвержденной директивными органами РФ. Ранее в своих исследованиях РА использовали ученые ВИЭВ (, 1948, , 1993), НИИСХ Крайнего Севера (, 1973).

Исходя из имеющихся сведений, мы поставили перед собой задачу разработать регламент приготовления АГ F. necrophorum и методику постановки РА.

2.2.3.1.1 Выбор культуры (изолята) в качестве антигена

Для исследования взяли 10 культур F. necrophorum, выделенных от больных некробактериозом животных с разной клинической формой.

Все культуры F. necrophorum хорошо росли на среде Китта-Тароцци или аминокровин-сывороточном бульоне (АКСБ) при температуре 37ºС. Десять исследуемых культур выделяли газы сероводород и индол, не расщепляли углеводы.

Культура F. necrophorum “ИВ” вызывала агглютинацию взвеси эритроцитов 5%-ой концентрации в разведении 1:32. Культура “Тл” агглютинировала 5%-ую взвесь эритроцитов до разведения 1:16, культуры “Ор1”, “Bn2”, “Эл”, “В” только до разведения 1:4. Слабой агглютинирующей способностью обладали культуры “Н”, “Ор2” - до разведения 1:2.

Вирулентные свойства культур F. necrophorum изучали на белых мышах. По данным таблицы 2 можно отметить, что наиболее патогенным для мышей оказалась культура “ИВ” F. necrophorum. На месте инъекции культуры “ИВ” F. necrophorum у всех мышей образовался некроз тканей. Она вызвала гибель всех мышей через 5-7 дней.

Культура F. necrophorum “Тл”, вызвала образование некроза на месте инъекции у всех животных в опытной группе. Гибель мышей составила 66,7 % через 7-8 дней в группе.

Таблица 2 – Результаты изучения патогенности культур F. necrophorum на мышах

Название культур F. necrophorum	Количество мышей	Время образования некроза (сутки)	Количество павших, гол./%	Время наступления летального исхода (сутки)
“Bn2	3	6	1/33,3	7
“Н”	3	6	0/0	-
“ИВ”	3	5	3/100	5-7
“Ор1”	3	8	0/0	-
“Ор2”	3	9	0/0	-
“Тл”	3	7	2/66,7	7-8
“Ол”	3	7	1/33,3	8
“Эл”	3	7	1/33,3	7
“Алт”	3	8	1/33,3	7
“В”	3	7	1/33,3	7
Контроль	3	-	-	-

Культуры “Bn2”, “Ол”, “Эл”, “Алт”, “В” также вызвали некроз тканей у всех мышей. Гибель животных составила 33,33% в каждой группе. Культуры “Н”, “Ор1”, “Ор2” вызвали некроз тканей на месте инъекции бактериальной взвеси, но все мыши оказались живыми.