Задача 3.3. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую реакцию:
Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат
и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная скорость реакции при различных концентрациях аспартата, фиксированной концентрации карбамоилфосфата (3 мМ) и фиксированной концентрации СТР (0,1 мМ) приведены в табл. 3.3.
Таблица 3.3
Концентрация аспартата, мМ | Скорость, мкмольфосфата/ч | |
нативный фермент | прогретый фермент + 0,1 мМ СТР | |
1,0 | 0,15 | 0,4 |
2,0 | 0,25 | 0,6 |
2,5 | 0,3 | 0,85 |
4,0 | 0,7 | 1,3 |
5,0 | 1,1 | 1,4 |
7,5 | 1,7 | 2,0 |
10,0 | 2,2 | 2,4 |
15,0 | 2,95 | 2,95 |
20,0 | 3,05 | 3,1 |
Определить кинетические параметры нативного и прогретого фермента: коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, Vmax, [S]0,5.
Задача 3.4. Аспартат-карбамоилтрансфераза катализирует следующую реакцию:
Аспартат + карбамоилфосфат → карбамоиласпартат + ортофосфат
и является первым ферментом при синтезе СТР. Активность фермента определяли по освобождению неорганического фосфата через определенные промежутки времени. Данные опытов, в которых определялась начальная скорость реакции при различных концентрациях аспартата, фиксированной концентрации карбамоилфосфата (3 мМ) и фиксированной концентрации АТР (2мМ) приведены в табл. 3.4.
Таблица 3.4
Концентрация аспартата, мМ | Скорость, мкмольфосфата/ч | |
нативный фермент | нативный фермент + 2 мМ АТР | |
1,0 | 0,15 | 0,4 |
2,0 | 0,25 | 0,55 |
2,5 | 0,3 | 0,9 |
4,0 | 0,7 | 1,35 |
5,0 | 1,1 | 1,4 |
7,5 | 1,7 | 2,0 |
10,0 | 2,2 | 2,4 |
15,0 | 2,95 | 3,0 |
20,0 | 3,05 | 3,1 |
Определить кинетические параметры нативного фермента и фермента в присутствии АТР: коэффициент Хилла, коэффициент крутизны, Vmax, [S]0,5.
Задача 3.5. Исследовалось влияние малеата на активность аллостерического фермента аспартат-карбамоилтрансферазы. В эксперименте использовался как нативный, так и прогретый фермент. Результаты, полученные в присутствии фиксированных концентраций аспартата и карьамоилфосфата (1 мМ и 3 мМ соответственно) и варьируемых концентраций малеата, приведены в табл. 3.5а.
Таблица 3.5а
Концентрация малеата, мМ | Скорость реакции, мкмоль фосфата/ч | |
нативный фермент | прогретый фермент (600С, 4 мин) | |
0 0,25 0,5 0,75 1,0 2,0 5,0 10,0 | 0,15 0,25 0,285 0,30 0,255 0,16 0,08 0,06 | 0,4 0,32 0,23 0,20 0,18 0,10 0,075 0,05 |
Механизм ингибирования прогретого фермента изучали, изменяя концентрацию аспартата при двух фиксированных концентрациях малеата. Использовали различные концентрации фермента. Полученные результаты приведены в табл. 3.5б.
Таблица3.5б
[Аспартат], мМ | Скорость реакции, мкмоль фосфата/ч | ||
без малеата | 1 мМ малеат | 2 мМ малеат | |
5 8 10 20 25 40 100 | 0,77 0,95 1,05 1,25 1,33 1,43 1,54 | 0,43 0,61 0,69 0,95 1,05 1,25 1,43 | 0,28 0,44 0,51 0,77 0,87 1,05 1,33 |
Какие выводы о регуляции активности фермента можно сделать на основании полученных данных?
Задача 3.6. Исследована кинетика действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из азотфиксирующих бактерий Azotobacter beijerinckii.
Глюкозо-5-фосфат + NADP+ ↔ 6-фосфоглюконат + NADPH + H+
Изучено влияние АТР на активность фермента. Получены приведенные ниже данные о зависимости начальной скорости реакции от концентрации глюкозо-6-фосфата в отсутствие и в присутствии АТР (при трех различных концентрациях); во всех опытах количество фермента (по белку) 0,75 мкг (табл. 3.6).
Таблица 3.6
[Глюкозо-6-Р], мМ | Начальная скорость восстановления NADP+, нмоль/мин | |||
концентрация АТР, мМ | ||||
0 | 1,25 | 0,625 | 0,3125 | |
0,375 0,500 0,625 0,750 0,875 1,000 1,250 1,500 1,750 2,000 2,250 2,500 | 5,15 9,65 10,95 14,15 15,45 18,65 22,70 23,80 27,00 29,00 | 0,35 0,43 0,58 0,97 1,29 2,25 3,54 5,15 8,05 9,83 12,90 16,60 | 0,64 0,97 2,75 5,47 8,69 10,60 14,80 16,10 16,70 | 1,48 1,93 5,15 9,97 13,00 15,10 26,40 |
По данным табл. 3.6 построить график в координатах v ; [S] и определить по нему Vmax. Для рассматриваемой системы Vmax = 29,5 нмоль/мин. Для определения коэффициента h (коэффициента взаимодействия, коэффициента Хилла) необходимо построить график Хилла.
Задача 3.7. Исследовалась кинетика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в гемолизатах клеток красной крови кроликов.
Раздел 4. Задачи к коллоквиумам и тестам
Задача 4.1. Фермент проявляет относительную специфичность. Определите, исходя из величины Км тот субстрат, который будет подвеграться каталитическому превращению с наибольшей скоростью при концентрации субстрат а, равной : а) Км= 2*10-1М; б) Км= 2*10-3М;в) Км= 2*10-4М; г) Км= 2*10-6М.
Задача 4.2. При изучении кинетики гидролиза ацетилхолина, катализируемого ацетилхолинэстеразой, было показано, что ферментативная реакция ингибируется субстратом с константой диссоциации неактивного тройного комплекса ЕS2, равной 3,2 10-2 М. Найти значение концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает максимального значения в условиях эксперимента, если величина константы Михаэлиса, найденная при использовании низких концентраций субстрата, равна 2,6 х·10-4 М.
Задача 4.3. Фермент имеет константу Михаэлиса, равную 0,035 М. Скорость реакции при концентрации субстрата, равной 0,110 моль/л, равна 1,15*10-3 моль/(л*с). Найдите максимальную скорость этой реакции.
Задача 4.4. Ферментативная реакция (Км = 2,7*10-3 М) подавляется конкурентным игибитором (КI = 3,1*10-5 М). Концентрация субстрата равна 3,6*10-4 моль/л. Сколько ингибитора потребуется для подавления реакции на 65%? Во сколько раз надо повысить концентрацию субстрата, чтобы уменьшить степень ингибирования до 25%?
Задача 4.5. Проанализируйте уравнение Михаэлиса-Ментен и ответьте на следующие вопросы:
а) При какой концентрации субстрата фермент, для которого максимальная скорость превращения субстрата составляет 30 мкмолей/мин мг, а величина КМ равна 0,005 М, будет работать со скоростью, равной 1/4 максимальной? б) Определите, какую долю VMAX, будет составлять скорость реакции при концентрациях субстрата, равных 1/2 КМ, 2КМ и 10Км.
Задача 4.6. Вирус иммунодефицита кодирует протеазу, которая необходима для внедрения и созревания вируса. Протеаза катализирует гидролиз субстрата (пентапептид) с начальной скоростью 0,0035 моль/с. Концентрация пентапептида равна 0,045 М. Константа Михаэлиса фермента для данного субстрата равна 0,075 М. Производное пентапептида, в котором пептидная связь замещена на –СН2NH, не гидролизуется протеазой и является ингибитором. В присутствии 2,5 мкМ ингибитора максимальная скорость равнялась 0,0093 моль/с, а начальная скорость составила 0,0030 моль/с. Определите тип ингибирования.
Задача 4.7. Вирус иммунодефицита кодирует протеазу, которая необходима для внедрения и созревания вируса. Протеаза катализирует гидролиз субстрата (пентапептид) с начальной скоростью 0,0035 моль/с. Концентрация пентапептида равна 0,045 М. Константа Михаэлиса фермента для данного субстрата равна 0,075 М. Определите VMAX фермента для пентапептида.
Задача 4.8. Гидролиз п-нитрофенилфосфата фосфатазой можно определить, измеряя скорость образования продукта п-нитрофенола. Используя стандартные условия (рН 7,0 и 250С) с суммарным объемом инкубационной среды, равной 5 мл, которая содержала 1 мкмоль фосфатазы, были определены Км и Vmax. Они были равны, соответственно, 2,0 мМ и 5 мМ/мин. Определите величину скорости реакции, когда 10 мкмоль п-нитрофенилфосфата присутствуют в инкубационной пробе. Сходный субстрат, о-нитрофенилфосфат имеет Км, равную 4 мМ при стандартных условиях. К какому из субстратов, п-нитрофенилфосфату или о-нитрофенилфосфату фермент имеет большее сродство?
Задача 4.9. Каталитическое расщепление пептидной связи в маленьких пептидах под действием фермента эластазы показало следующие результаты:
Субстрат | Км (М) | Число оборотов моль S/с*моль фермента |
РАРА-G | 4,0 | 26 |
PAPA-A | 1,5 | 37 |
PAPA-F | 0,64 | 18 |
Определите пептид, который расщепляется наиболее быстро и наиболее медленно, если все субстраты были взяты в концентрации 0,5 М.
Задача 4.10. Гидролиз п-нитрофенилфосфата фосфатазой можно определить, измеряя скорость образования продукта п-нитрофенола. Используя стандартные условия (рН 7,0 и 250С) с суммарным объемом инкубационной среды, равной 5 мл, которая содержала 1 мкмоль фосфатазы, были определены Км и Vmax. Они были равны, соответственно, 2,0 мМ и 5 мМ/мин. Определите величину скорости реакции, когда 10 мкмоль п-нитрофенилфосфата присутствуют в инкубационной пробе. Сходный субстрат, о-нитрофенилфосфат имеет Км, равную 4 мМ при стандартных условиях. К какому из субстратов, п-нитрофенилфосфату или о-нитрофенилфосфату фермент имеет большее сродство?
Задача 4.11. Карбоангидраза эритроцитов, имеющая молекулярную массу 30000, - один из самых активных ферментов, известных в настоящее время. Она катализирует обратимую реакцию гидратации СО2
Н2О + СО2 ↔ Н2СО3,
которая играет важную роль в транспорте СО2 из тканей в легкие. Рассчитайте число оборотов карбоангидразы, если при оптимальных условиях 10 мкг чистой карбоангидразы катализируют гидратацию 0,30 г СО2 в 1 мин при 370С.
Задача 4.12. При изучении кинетики гидролиза ацетилхолина, катализируемого ацетилхолинэстеразой, было показано, что ферментативная реакция ингибируется субстратом с константой диссоциации неактивного тройного комплекса ЕS2, равной 3,2 10-2 М. Найти значение концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает максимального значения в условиях эксперимента, если величина константы Михаэлиса, найденная при использовании низких концентраций субстрата, равна 2,6 х·10-4 М.
Задача 4.13. После инкубации с п-хлормеркурибензоатом связывание фермента с субстратом не изменилось по сравнению с необработанным ферментом, но каталитическая активность фермента уменьшилась на 40%. Какой вывод можно сделать из этого наблюдения.
Задача 4.14. Гидролиз ацетилхолина, катализируется ацетилхолинэстеразой, число оборотов которой составляет 25000 с-1. Сколько времени потребуется ферменту для расщепления одной молекулы ацетилхолина?
Задача 4.15. Фермент имеет константу Михаэлиса, равную 0,035 М. Скорость реакции при концентрации субстрата, равной 0,110 моль/л, равна 1,15*10-3 моль/(л*с). Найдите максимальную скорость этой реакции.
Задача 4.16. Ферментативная реакция (Км = 2,7*10-3 М) подавляется конкурентным игибитором (КI = 3,1*10-5 М). Концентрация субстрата равна 3,6*10-4 моль/л. Сколько ингибитора потребуется для подавления реакции на 65%? Во сколько раз надо повысить концентрацию субстрата, чтобы уменьшить степень ингибирования до 25%?
Задача 4.17. Используя график для уравнения 1.3, изобразите завтсимость скорости реакции от [S]. Используйте значения Vmax = 100 мкмоль с-1 и Км = 10 мкМ. Как сильно возрастет v0 при удвоении значения [S] от 0,2 до 0,4 мкМ? Чему равно v0 при [S] = 10 мкМ? Как увеличится v0 при увеличении [S] от 100 до 200 мкМ? Обратите внимание на изменение вида графика при двукратном увеличении или уменьшении значений Vmax или Км. Используя уравнение лайнутвера-Берка постройте зависимость в координатах двойных обратных величин для всех случаев перечисленных в вышеприведенных заданиях.
Библиографический список
1. Варфоломеев энзимология: Учебник. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 480 с.
2. , Клёсов курс химической и ферментативной кинетики. – М.: Изд-во МГУ, 1978. – 320 с.
3. Биохимия с упражнениями и задачами: Учебник / под ред. чл.-корр. РАН, проф. . – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 384 с.
4. Ферменты. В 3-х тт. – М.: Мир, 1982. – 1120 с.
5. Количественные проблемы биохимии. – М.: Мир, 1983. – 376 с.
6. , Мушкамбаров и термодинамика биохимических и физиологических процессов.- М.: Медицина, 1990. – 208 с.
7. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1990. – 348 c.
8. Биохимическая логика. – М.: Мир, 19с.
9. Корниш- Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1979. – 277 с.
10. Курганов ферменты. – М.: Наука, 19с.
11. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т.1 ; пер. с англ. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. – 604 с.
12. Price N. C., Stevens L. Fundamental of Enzymology. The Cell and Molecular Biology of Catalytic Proteins. Third Edition. – Oxford, University Press, 2003. – 478 p.
Электронные ресурсы
1. www. virginia. edu.
2. www. .
3. www. ncbi. nlm. nih. gav.
4. www. *****.
5. www. high. stanford. edu.
6. www. wikipedia. org.
Оглавление
Введение | 4 |
Раздел 1. Уравнение Михаэлиса-Ментен | 4 |
1.1.Характеристика кинетических констант | 8 |
1.2.Методы определения Км и Vmax | 8 |
1.3.Задачи к разделу 1. | 11 |
Раздел 2. Ингибиторы ферментов | 22 |
2.1.Конкурентное ингибирование | 24 |
2.2.Неконкурентное ингибирование | 25 |
2.3.Бесконкурентное ингибирование | 26 |
2.4.Смешанный тип ингибирования | 27 |
2.5.Методы определения константы ингибирования | 29 |
2.6.Субстратное ингибирование | 30 |
2.7. Задачи к разделу 2 | 31 |
Раздел 3. Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен | 46 |
3.1. Уравнение Хилла | 49 |
3.2. Методы определения коэффициента Хилла | 52 |
3.3.Определение коэффициента крутизны Кошланда | 53 |
3.4. Задачи к разделу 3 | 53 |
Раздел 4. Задачи к коллоквиумам и тестам | 58 |
Библиографический список | 62 |
Учебное издание
Подготовлено к изданию РИО БИК СФУ
Подписано в печать 2012 г. Формат 60х84/16
Бумага офсетная. Печать плоская
Усл. печ. л. Уч.-изд. л.
Тираж экз. Заказ (дает РИО)
Редакционно-издательский отдел
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
г. Красноярск, пр. Свободный, 79
Тел/факс (3E-mail *****@***ru
http://rio. *****
Отпечатано Полиграфическим центром
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
г. Красноярск, пр. Свободный, 82а
Тел. ,
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 |
