УТВЕРЖДАЮ
Директор УНИИ ФиФ, доктор мед. наук Член-корр. АТН РФ, профессор
_.............................. Л. П. ЛАРИОНОВ
ОТЧЕТ
ОБ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ОБЩЕЙ ТОКСИЧНОСТИ, СПЕЦИФИЧЕСКОГО
И АЛЛЕРГИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СПРЕЯ "МОРФЕЙ'
ЕКАТЕРИНБУРГ
1998
ОГЛАВЛЕНИЕ.
№№ Наименование разделов Страницы
п/п
Оглавление........................................................................................ 2
Введение ................................................................... 4
Глава 1. Экспериментальное исследование специфической и общей фармакологической активности биологически
активного спрея "Морфей"....................................... 5
1.1. Задачи исследования............................................................ 5
1.2. Материалы и методы................................................. 5
1.2.1. Характеристика животных......................................... 5
1.2.2. Методы исследования................................................ 5
1.2.2.1. Специфическое действие при лечении термических
ожогов................................................................................ 5
1.2.2.2. Влияние спрея "Морфей" на состояние животных при
выполнении физической нагрузки............................. 5
1.2.2.3. Определение жизнеспособности моноцитов........................... 5
1.2.2.4. Определение транскутанной активности спрея "Морфей"
(кожно - резорбтивное действие) ................................ 6
1.2.2.5. Экспериментальное изучение токсичности препаратов 6
1.2.2.5.1.Определение острой токсичности........................... 7
1.2.2.5.2.Определение хронической токсичности............................. 7
1.2.2.6. Оценка местного действия спрея "Морфей"................... 7
1.2.2.7. Оценка кумулятивных свойств спрея.......................... 7
1.2.2.8. Статистическая обработка результатов исследований 7
1.2.2.9. Изучение аллергизирующего действия спрея "Морфей" 7
1.2.2.9.1 .Метод накожных аппликаций............................................ 7
1.2.2.9.2. Конъюнктивальная проба................................... 8
1.2.2.9.3. Реакция общей анафилаксии (анафилактический
шок)...................................................................... 8
Глава 2. Результаты экспериментальных исследований........................ 9
2.1. Специфическое действие
на модели термических ожогов............................................ 9
2.2. Действие спрея при выполнении физической нагрузки 11
2.3. Изучение жизнеспособности моноцитов..................... 11
2.4. Результаты изучения транскутанной активности (кожно-
резорбтивное действие) спрея "Морфей"............................... 11
2.5. Результаты изучения токсического действия спрея
"Морфей"................................................................... 13
2.5.1. Острая токсичность.............................................................. 13
2.5.2. Хроническая токсичность.......................................... 13
2.5.2.1. Влияние спрея на общее состояние животных............. 13
2.5.2.2. Влияние спрея на кроветворение......................... 13
2.5.2.3. Влияние спрея на функцию печени и почек............................ 14
2.5.3. Результаты изучения аллергизирующего действия
спрея......................................................................... 20
2.5.3.1. Метод накожных аппликаций............................................... 20
2.5.3.2. Конъюнктивальная проба.................................................... 20
2.5.3.3. Реакция общей анафилаксии................................. 20
2.6. Местное действие спрея "Морфей"........................................ 21
2.7. Кумулятивные свойства спрея "Морфей".......................... 21
2.8. Тератогенная и канцерогенная активность спрея "Морфей" 21
Заключение..................................................................................... 24
Литература............................................................................ 25
ВВЕДЕНИЕ.
На рубеже XX и XXI столетий экологическая обстановка во всём мире становится всё более напряжённой: увеличивается количество токсических веществ в воздухе и почве, ухудшается качество питьевой воды, уменьшается лесной массив. В то же время возрастает число стрессовых ситуаций как в глобальном масштабе, так и индивидуальных. На этом фоне возрастает опасность возникновения различных заболеваний, особенно болезней сердечно-сосудистой системы, туберкулёза, онкологического профиля и т. д.. Уступит организм болезни или будет устойчив к потенциально патогенным факторам? Болезнь возникает в результате недостаточности адаптивных механизмов, их истощения и срыва. Отсюда становится очевидной необходимость своевременной помощи, которая может быть оказана не только с помощью огромного арсенала лекарственных средств, но и при помощи адаптогенов, витаминов, антигипоксантов растительного происхождения и т. д.
В г. г. сотрудниками СГМИ г. Екатеринбурга были разработаны методические рекомендации для работников тяжёлого и транспортного машинострое-ния[10], связанных с профессиональными вредностями. Был разработан кислородный коктейль, позволивший сократить общую заболеваемость на 25-30%, повысить рези-стентность организма к гипоксии, к токсическим веществам и т. д.
В 1993 г. Разрешён к промышленному выпуску и применению в медицинской практике чрезкожный проводник биологически активных веществ - эфтидерм [5, 19]. Он не только проводит через кожу и слизистые оболочки эти вещества, но усиливает и пролонгирует их действие, снижает число осложнений, повышает жизнеспособность клеточных мембран, является сильным антиоксидантом. При добавлении 5 -10% эфтидерма в коктейли - их действие значительно возрастает.
С целью профилактики и коррекции ряда заболеваний, повышения устойчивости организма к экстремальным факторам, профилактики неврозов и нарушений сна был разработан биологически активный спрей "Морфей". Он может быть использован населением, особенно в экологически неблагоприятных районах, а также лицами, работа которых связана с нервными перегрузками: работникам дошкольных учреждений, учителям, людям, работающим в сфере бытового обслуживания и т. д.. Спрей "Морфей" предназначен для нормализации обмена веществ, дезинтоксикации, повышения сопротивляемости организма к факторам внешней среды.
Исследование спрея "Морфей" на экспериментальных животных было проведено по требованиям Фармакологического комитета МЗ РФ.
Глава 1. Экспериментальное исследование специфической и общей фармакологической активности биологически активного спрея "Морфей"
1.1. Задачи исследования.
С целью выявления фармакологической активности, специфического действия и возможных осложнений было проведено изучение биологически активного спрея "Морфей ", в дальнейшем "Спрей" в сравнении с эфтидермом и кислородным коктейлем ( в дальнейшем - "Коктейль ") идентичного состава, но без эфтидерма.
1.2. Материалы и методы.
Исследования проведены Уральским НИИ фармакологии и фармации ( кафедра фармакологии Уральской медицинской Академии) и ЛДФ "Медик" г. Екатеринбурга.
1.2.1. Характеристика животных
В экспериментах использовали нелинейных белых крыс, мышей, морских свинок-альбиносов, кроликов породы «шиншилла». Животных содержали при температуре 18-20,5° С в условиях естественного светового цикла на стандартной диете, при свободном доступе к воде и пище. В эксперимент отбирали только здоровых животных, прошедших двухнедельную адаптацию к условиям вивария [ 8 ].
1.2.2. Методы исследования
1.2.2.1. Специфическое действие при лечении термических ожогов
Кроликам-самцам породы «Шиншилла» массой 1г и кры
сам-самцам линии Вистар стадного разведения массой г под общим обезбо
ливанием наносили термический ожог термокаутером соответственно группе живот
ных на участке 10 см2 - кроликам и 4 см2 - крысам в области спины справа, где за су
тки до этого была удалена шерсть.
Сразу после операции и затем ежедневно в 11 часов дня до наступления полной эпителизации - на ожоговые поверхности шпателем наносили препараты, соответственно группе животных. Дополнительного лечения не применяли. При кровотечении накладывали давящую повязку с испытуемым средством.
На 5 сутки после полной эпителизации изучали периферическую кровь, проводили биохимические исследования. Животных взвешивали один раз в неделю, постоянно вели наблюдение за общим состоянием, поведением, размером ран. Каждые 3 дня проводили микроскопию мазков-отпечатков.
1.2.2.2. Влияние спрея "Морфей" на состояние животных при
выполнении физической нагрузки
Животным один раз в день трижды вводили в желудок испытуемые препараты. Через 24 часа давали физическую нагрузку - плавание. Фиксировали время, в течение которого мыши свободно плавали, не погружаясь в воду. (Контрольные животные получали дистиллированную воду).
1.2.2.3. Определение жизнеспособности моноцитов
Для определения жизнеспособности моноцитов (мембраностиму-лирующее действие) применяли методику определения функциональной активности макрофага [14,16]. Эксперимент проводили на мышах весомг. Животные (кроме контрольных) получали препарат соответственно группе из расчёта 0,5 г/кг веса один раз в сутки 3 дня подряд. Затем у всех животных была взята кровь (от каждой мыши отдельно), выделены моноциты Суспензию полученных моноцитов разво-
дили в среде 199 до содержания клеток 107/мл, затем разливали в 10 стерильных чашек Петри (от каждой мыши) из расчёта 2-3 миллиона клеток на одну, ставили на час в термостат при температуре 37° С, отмывали чашки раствором 199, причём моноциты оставались прикреплёнными ко дну чашек, 5 из них (в т. ч. одна контрольная) заливали на три минуты 1% раствором трепанового синего, затем смывали краску физиологическим раствором хлорида натрия и считали под микроскопом непосредственно в чашках Петри количество живых моноцитов на 100 клеток. 4 из оставшихся чашек Петри были подвергнуты воздействию экстремальных факторов соответственно группе и изучаемым препаратам, 1 - контрольная. После этого вновь проводили часовую инкубацию в термостате с последующей отмывкой средой 199, окраской 1% раствором трепанового синего. Отмывали чашки изотоническим раствором хлорида натрия и считали под микроскопом количество живых клеток.
1.2.2.4. Определение транскутанной активности спрея "Морфей" ( кожно-
резорбтивное действие)
Для проведения эксперимента использовали полярографическую ячейку, герметично разделённую на две части кожей новорожденного крысёнка. Обе части заполняли стерильным 0,89% раствором хлорида натрия. В часть ячейки, прилегающую к поверхности кожи, вносили биологически активные вещества в количестве 0,01 г, получали 1% раствор. Непрерывно вели полярографическую запись, на которой регистрировалось время появления исследуемого вещества во второй части ячейки, где находился рабочий платиновый электрод. [4]. В качестве электрода сравнения применяли хлорсеребряный электрод. После каждого исследования ячейки промывали изотоническим раствором хлорида натрия. Следующие исследования проводили, заполняя ячейки 20% растворами изучаемых чрезкожных проводников. Во всех случаях изучали скорость проведения через кожу аскорбиновой и салициловой кислоты, йодистого калия, тетрациклина. Время в минутах учитывали по полярограмме.. 1.2.2.5. Экспериментальное изучение токсичности препаратов.
Исследования проведены согласно методическим рекомендациям: «Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ» [9, 11, 13, 17]. При определении накожного действия все изучаемые вещества наносили на участок кожи с выстриженной шерстью размером 2x2 см - для мышей; 4x4 см - для крыс; 7x8 см - для кроликов. Стрижку шерсти производили каждые 7 дней.. Исследуемые вещества наносили один раз в сутки в 11 часов дня стеклянной палочкой или пипеткой и равномерно распределяли по всей поверхности При необходимости нанесения большой дозы манипуляцию повторяли через 2-3 минуты после «впитывания» предыдущей порции. Густые формы смешивали с водой в соотношении 1 : 4 (везде указывали применяемую дозу в пересчёте на 100% препарата). После нанесения на кожу исследуемых веществ - всех животных фиксировали общепринятыми способами на 4 часа, кроме мышей, которых фиксировали на 2 часа. В желудок препараты вводили эластическим зондом. За животными вели наблюдение по общепринятой схеме. Перед экспериментом, каждые 10 дней в период исследований и через 2 недели после последнего применения препарата - изучали показатели периферической крови, мочи, общий белок, остаточный азот, сахар крови, резистентность эритроцитов, ЭКГ, определяли число дыхательных движений в одну минуту. Затем проводили эвтаназию, взвешивали и брали на гистологическое исследование печень, почки, селезёнку, сердце, лёгкие, желудок, кожу на месте нанесения
мази, щитовидную и поджелудочную железы, надпочечники. Окраску препаратов осуществляли гематоксилином и эозином, микрофото готовили с увеличением в 140 или 200 раз.
1.2.2.5.1. Определение острой токсичности
Эксперимент проводили на мышах весомг, крысах - самцах массой г и морских свинках-альбиносах массой г. Изучаемые препараты вводили однократно.
1.2.2.5.2. Определение хронической токсичности
Эксперимент проводили на белых мышах массойг, крысах - самцах массой г и морских свинках-альбиносах массой г. Препараты вводили ежедневно в течение 30 дней.
1.2.2.6. Оценка местного действия спрея "Морфей"
Эксперимент проводили на крысах обоего пола массой г. У всех животных была выстрижена шерсть на участках 4x4 см с двух сторон от поясничного отдела позвоночника. На правый бок однократно наносили 200 мг/см испытуемого препарата соответственно группе. На левый бок, который служил контролем, наносили дистиллированную воду. Животных на 4 часа помещали в индивидуальные домики. Оценку результатов проводили через 4, 5 и 20 часов после нанесения препаратов по , [ 1, 2, 3, 15 ].
1.2.2.7. Оценка кумулятивных свойств спрея
Кумулятивные свойства вещества характеризуются коэффициентом кумуляции, который равен отношению ЛД50 при однократном введении к ЛД5о при кратном введении. Учитывая невозможность определения ЛД5о спрея из-за его малой токсичности - за ЛД50 принят максимально вводимый объём. При пероральном введении эта доза составляет 25 г/кг, при накожном применении - 15 г/кг, как при однократном, так и при многократном приёме.
Следовательно, индекс кумуляции при пероральном приёме равен -
25 г/кг: 25 г/кг = 1, при накожном - 15 г/кг : 15 г/кг = 1, а спрей "Морфей" не обладает кумулятивной способностью.
1.2.2.8. Статистическая обработка результатов исследований Анализ результатов исследований проводился на персональной IBM-486 с помощью пакета прикладных программ: Microsoft Word, Microsoft Access, Microsoft Exsel при использовании традиционных методов вариационных отклонений. Показатель достоверности различий определяли по t - критерию Стьюдента, различия считали достоверными при р < 0,05. Единицы измерений приведены в системе СИ [6, 18]. 1.2.2.9. Изучение аллергизирующего действия препаратов 1.2.2.9.1. Метод накожных аппликаций
Эксперимент проведен на крысах линии Вистар стадного разведения массой г (поровну самцов и самок). На спинке слева была выстрижена шерсть на участке 4x4 см. Проводили эпикутанную сенсебилизацию путём нанесения трёх капель изучаемого раствора или 0,5 г препарата один раз в день 5 раз в неделю в течение 20 суток. За животными вели наблюдение по общепринятой схеме, особое внимание уделяли состоянию кожи на месте нанесения испытуемых веществ. Первое тестирование проводили через 24 часа после десяти нанесений препаратов на кожу, второе - через 24 часа после 20. Оценка была проведена по пятибальной системе [2,
-
3, 12].
1.2.2.9.2. Конъюнктивальная проба.
Эксперимент проводили на крысах массой г и морских свинках массой г. На участок кожи на спине размером 4x4 см с выстриженной шерстью ежедневно в течение 20 дней наносили испытуемые препараты соответственно группе. Через 24 часа после двадцатой аппликации всем животным была проведена конъюнктивальная проба. Для этого под верхнее веко правого глаза вводили по одной капле препарата, смешанного с дистиллированной водой в соотношении 1:10. Левый глаз служил контролем, под верхнее веко была введена одна капля дистиллированной воды. Оценку результатов проводили трижды: через 15 минут, 24 и 48 часов после проведения конъюнктивальной пробы.
1.2.2.9.3. Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)
Эксперимент проведен на морских свинках. Все животные были
сенсибилизированы путём трёхкратного введения препарата, соответствующего группе, через день: первый день - подкожно, третий и пятый день - внутримышечно из расчёта 1г/кг массы, животным одной из групп бьш введен эфтидерм из расчёта 0,1 г/кг веса внутрисердечно. Оценка степени анафилактического шока была проведена по Weigle [1,2,3, 12].
Глава 2. Результаты экспериментальных исследований
2.1. Специфическое действие на модели термических ожогов Результаты исследований представлены в таблицах 1-3.
Заживление очагов у крыс произошло по разному. Самая быстрая эпителизация была отмечена у животных, получавших лечение эфтидермом, - на 37,7 % скорее, чем у контроля, и у животных, получавших лечение спреем "Морфей" - на 42,4 % скорее, чем в контроле. У животных, получавших лечение коктейлем, заживление про изошло лишь на 11,4 % быстрее, чем у животных контрольной группы. Необходимо отметить, что у всех животных 3-4 групп со 2-3 дня лечения резко уменьшились явления воспаления в очагах: отёк и инфильтрация тканей, гиперемия, началась крае вая эпителизация. Их поведение практически не отличалось от поведения интактных животных. При взвешивании крыс через 7 и 14 дней после нанесения ожогов они прибыли в весе на%, контрольные практически не прибыли в весе, а крысы 5 руппы прибыли в весе только на% (прирост веса интактных животных был принят за 100 %).
Наибольшие изменения периферической крови были в контрольной группе. Здесь произошло снижение числа эритроцитов на 20,9 %, повышение количества ретикуло-цитов составило 82,8%, что свидетельствовало об анемизации животных, а повышение лейкоцитов на 76,9% - соответствовало выраженной воспалительной реакции в области ожоговых ран.
Таблица 1
Распределение крыс по группам, осложнения, сроки заживления экспериментальных ожогов
№№ группы | Применяемые лекарственные средства | Крово течение | Заживление в сутках | Средние сроки заживления | |||
5-10 | 11-15 | 16-20 | Свыше 20 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
1. | Интактные | Ожоги не вызывали | |||||
2. | Контроль (без лечения) | 3 | - | - | 4 | 6 | 21,0±1,86 |
3. | Эфтидерм | - | 4 | 5 | 1 | - | 13,2+0,84 |
4. | Спрей "Морфей" | - | 7 | 3 | - | - | 12,1+0,41 |
5. | Коктейль | 2 | - | 2 | 5 | 3 | 18,6+0,98* |
Примечание: Недостоверные величины при р > 0,05 отмечены *. Сравнение проведено с контрольной группой, п = 10.
10
Минимальные изменения крови при благоприятном течении процесса бьши отмечены у крыс, получавших эфтидерм и спрей "Морфей". Изменения биохимических показателей крови во всех группах были недостоверными, хотя во 2-ой и 5-ой группах наметилась тенденция к снижению общего белка, повьппению содержания холестерина и мочевины.
Таблица 2
Показатели периферической крови крыс-самцов после
эпителизации ожогов
груп пы | Эритроциты 1012/л | Тромбоциты 109/л | Лейкоциты 109/л | Лейкоцитарная формула, % | Рети-куло-циты % | Резистент-ность эритроцитов, % | ||
Эозино-филы | Моноциты | Лимфоциты | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
1. | 4,3 +0,08 | 392,8 ±8,17 | 3,9 +0,11 | 0,4 +0,03 | 3,6 ±0,18 | 69,8 ±1,84 | 2,9 ±0,09 | 0,36 ±0,02 |
2. | 3,4 + 0,09 | 432,4 + 9,54 | 6,9 +0,52 | 0,9 +0,04 | 8,4 ±0,39 | 74,8 ±2,12 | 5,3 ±0,23 | 0,30 ±0,02 |
3. | 4Д +0,18 | 408,6 +5,43 | 5,6 ±0,36 | 0,5 +0,01 | 4,3 ±0,11 | 71,6 ±1,96 | 3,8 ±0,13 | 0,32 ±0,01 |
4. | 4,2 + 0,21 | 398,5* +9,65 | 4,6 +0,31 | 0,3 ±0,01 | 4,7 ±0,14 | 71,0* ±4,25 | 3,5 ±0,11 | 0,34 ±0,02 |
5. | 3,8 +0,10 | 400,3 +6,14 | 5,9 +0,41 | 0,7 ±0,03 | 5,5 ±0,12 | 72,6* ±2,34 | 4,1 ±0,24 | 0,31 ±0,02 |
Примечание: Недостоверные величины при р > 0,05 отмечены *. Сравнение проведено с контрольной группой, п = 10.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
