Иммуномодулирующее действие стоматологических материалов (стр. 2 )

XIX Всероссийской конференции «Актуальные проблемы стоматологии». (Москва 2008);

На совместном заседании кафедры госпитальной ортопедической стоматологии, кафедры стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО, кафедры ортопедической стоматологии ФПДО, лаборатории материаловедения НИМСИ, кафедры патологической физиологии стоматологического факультета, кафедры патологической физиологии лечебного факультета, кафедры биохимии МГМСУ (Москва, 2010).

Публикации

По материалам диссертации в центральной печати опубликовано 25 печатных работы, в том числе 14 публикаций - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объём и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 233 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 331 источник, из них 183 отечественных и 148 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 63 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Экспериментальная часть работы проведена на кафедре патологической физиологии стоматологического факультета МГМСУ (зав. каф. до 2009 года, з. д.н. РФ., д. м.н., профессор ) и ГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (зав. лаб., д. б.н., ). В экспериментах оценивали иммуномодулирующий и цитотоксический эффект 4 различных групп стоматологических материалов. Опыты проводили на мышах-самцах линии (СВА х С57BL/6)F1, массой 23-25 г. в возрасте от 8 до 12 недель. Всего было задействовано 1275 животных, которых содержали в соответственно оборудованном виварии с достаточным освещением и вентиляцией в специальных клетках, закрывающихся металлической сеткой.

Все экспериментальные животные были разделены на 5 серий опытов. На мышах 4-х серий изучалось иммуномодулирующее действие имплантированных под кожу стоматологических материалов (СМ) на фоне только внутрибрюшинного введения овальбумина (ОА).

Животным первой серии были имплантированы образцы отечественных стоматологических сплавов металлов «Нержавеющая сталь» (НС), кобальто-хромовый сплав «Бюгодент», золото-платиновый сплав «Супер-КМ» и палладиевый сплав «Суперпал». Животным второй серии были имплантированы образцы акриловых пластмасс «Этакрил», «Фторакс»(Украина), «Стомакрил»(Россия), полимеризованные на водяной бане (ВБ) и СВЧ-методом. Животным третьей серии проводилась подкожная имплантация реставрационных стоматологических материалов (РСМ) светового отверждения: «Призмафил Плюс»(Россия), «Филтек Z-250»(США), «Геркулайт XRV»(США). Животным четвертой серии имплантировали образцы корневых паст: «Эндометазон», «Цинкоксидэвгенол», «Форедент», «Сеалит Регуляр». У мышей пятой серии вызывали экспериментальную бронхиальную астму (БА) путём внутрибрюшинного и интраназального введения ОА, У животных этой серии изучали сенсибилизирующее действие базисных акриловых пластмасс, полученных разными способами полимеризации.

Контрольные группы во всех сериях были представлены животными, которых иммунизировали только ОА без имплантации СМ, а в 5-ой серии эксперимента была вторая контрольная группа, представленная интактными животными.

Атопическую аллергическую реакцию у экспериментальных животных вызывали путём сенсибилизации овальбумином. Препарат разводили в растворе Хэнкса, в дозе 10 мкг на мышь и внутрибрюшинно вводили в объеме 500 мкл. Однократным введением ОА вызывали первичный иммунный ответ (первичная иммунизация); через две недели повторяли введение ОА (вторичная иммунизация); на 5 неделе эксперимента проводили третичную иммунизацию. Образцы СМ имплантировали за неделю, одновременно и через неделю после первичной иммунизации. Через 2 недели после первичной иммунизации, через 1 неделю и через 3 недели после вторичной и третичной иммунизации под гексеналовым наркозом (0,1 мл 1% раствора на 10 г веса животного) у животных из ретроорбитального синуса забирали по 150 мкл венозной крови. Далее животных выводили из опыта с соблюдением правил эвтаназии, согласно Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Полученные пуловые сыворотки хранили на холоду при -30°С. Определение анти-ОА антител (анти-IgЕ и анти-IgG) в пуловых сыворотках мышей осуществляли методом твёрдофазного иммуноферментного анализа в нашей модификации.

У мышей 5-й серии моделировали краткосрочную IgE-зависимую бронхиальную астму по следующей методике: мышей иммунизировали 7 раз через день внутрибрюшинно ОА в дозе 0,5 мкг/г. Через 4 недели после последней внутрибрюшинной инъекции ОА мышам ежедневно проводили интраназальные аппликации раствора ОА объёмом 50 мкл в концентрации 10 мг/мл в течение 8 дней. Все животные этой серии были разделены на 5 групп. Мышам 1-ой и 3-ей групп через 2 недели после последней иммунизирующей инъекции ОА подкожно имплантировали диски, изготовленные из акриловой пластмассы весом 500 мг, в одном случае - полимеризованной на водяной бане (ВБ) (1-ая группа), а в другом – СВЧ методом (3-я группа). Мыши 2-ой группы были ложно оперированы. Мышей 4-ой группы (контроль сенсибилизации) иммунизировали по схеме 1-ой и 3-ей групп, а интраназальные аппликации проводили физраствором (0,9% NaCl). Контролем служили интактные животные 5-ой группы, которые не подвергались никаким манипуляциям. Через 48 часов после последней интраназальной аппликации ОА животных выводили из эксперимента. У мышей всех групп осуществляли забор бронхоальвеолярного лаважа и крови из ретроорбитального синуса.

Методика подготовки стоматологических материалов и методы их имплантации животным. Образцы сплавов металлов «Бюгодент», «Суперпал» и «Супер КМ» размером 5х1 мм изготавливали методом центробежного вакуумного литья, а образцы из «НС» вырезали из гильзы алмазным диском. Полученные образцы металлов шлифовали и полировали. Для изготовления образцов из пластмассы, восковые шаблоны помещали в кюветы с гипсом, при высокой температуре выплавляли воск и заменяли на пластмассу «Этакрил», «Фторакс» или «Стомакрил». Часть образцов полимеризовали на водяной бане, а другую часть СВЧ-методом. Образцы реставрационных материалов светового отверждения помещали в клише из силикона размером 5х1 мм и полимеризовали в течение 40 секунд световым излучением. Для получения образцов корневых паст вначале соединяли компоненты в пропорциях согласно инструкции производителя. Далее образцы вносили в круглые планшеты с плейтами из пластика до полного застывания. Все полученные образцы имплантировали под гексеналовым наркозом под кожу в область спины.

Для гистологического исследования мышей выводили из опыта под гексеналовым наркозом через 1 месяц после имплантации. Вырезанный участок кожи вместе с имплантатом и подкожной клетчаткой, фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение недели, проводили через спирты восходящей плотности и заливали в парафин. Готовили срезы толщиной 7-8 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. В световом микроскопе в препаратах оценивали состояние капсулы, ее клеточный состав, сосуды и межклеточные структуры. Для дифференцировки клеток бронхоальвеолярного лаважа ( БАЛЖ) готовили мазки на предметных стёклах, фиксировали их в метаноле, окрашивали по Романовскому-Гимза и подсчитывали процентное соотношение клеток.

Клиническая и лабораторная часть работы проведена во взрослой поликлинике Центра стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ. Обследовано 808 пациентов обоего пола в возрасте от 17 до 83 лет, из которых 444 пациента имели в анамнезе атопическую аллергию (АА) и 364 пациента без признаков АА.

В соответствии с методикой и рекомендациями ВОЗ по репрезентативности выборки за период гг. проведено стоматологическое эпидемиологическое обследование амбулаторных карт 250 пациентов с АА [(66 пациентов с бронхиальной астмой (БА), 80 пациентов с атопическим дерматитом (АД) и 104 человека с аллергическим ринитом (АР)], обратившихся за стоматологической помощью во взрослую поликлинику Центра стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ, которое предусматривало изучение показателей стоматологического статуса среди всех возрастно-половых групп взрослых пациентов.

Из общего числа обследованных пациентов с АА 104 человека дали согласие на ортопедическое лечение. Из них 20 человек с БА, 31 человек с АД, и 52 человека с аллергическим ринитом. Контрольную группу (n=104) составили пациенты без АА, (ортопедическое лечение пациентов проводилось на кафедре госпитальной ортопедической стоматологии МГМСУ (зав. каф., з. д.н. РФ, д. м.н., проф. ) и в ортопедическом отделении стоматологической поликлиники № 5 г. Москвы. У пациентов до начала лечения исследовали состояние имеющихся зубов и зубных рядов, определяли степень подвижности зубов, проводили рентгенологическое обследование (внутриротовая прицельная рентгенография и ортопантомография), оценивали интенсивность кариеса по индексу КПУ, гигиену полости рта по индексу OHS-I, пародонтальный статус по индексам SBI и PMA в модификации Parma (1960). Все участники исследования на основании показаний к протезированию были рандомизированы в четыре группы. Пациентам 1-ой группы было проведено ортопедическое лечение с применением съёмных пластиночных протезов (СП), 2-ой группы - металлокерамическими мостовидными протезами и одиночными коронками (МК), 3-ей группы – бюгельными протезами (БП). Для изготовления съёмных протезов пациентам были использованы акриловые пластмассы «Фторакс» и «Этакрил», полимеризованные СВЧ-методом. Каркасы металлокерамических зубных протезов изготавливались из сплавов «Суперпал», «Супер КМ», «Бюгодент». Для каркасов бюгельных протезов использовали сплав «Бюгодент» и акриловую пластмассу «Фторакс» и «Этакрил».

Адаптационную способность тканей полости рта после проведённого лечения оценивали на основании анализа жалоб, результатов осмотра, данных индексов, биохимических показателей смешанной слюны. Сбор смешанной слюны проводили путём сплёвывания в стеклянную пробирку в течение 5 минут до препарирования зубов и снятия анато­мических оттис­ков, затем через 1 неделю, 1 и 6 месяцев по­сле ортопедического лечения. Полученные образцы слюны центрифугировали и в супернатанте на спектрофотометре «StatFax 1904 plus» определяли активность аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) в МЕ/л, содержание иммуноглобулинов (Ig) А, G и М в мг/дл. Также определяли объём выделяемой слюны (мл), скорость секреции слюны (мл/мин) и рН слюны.

Пациентам с АА и пациентам контрольной группы для выявления индивидуальной гиперчувствительности к СМ проводили диагностику in vivo и in vitro, включающую накожный патч-тест, метод высвобождения гистамина из базофилов крови, метод определения в сыворотке крови и смешанной слюне IgE - и IgG-специфических антител на следующие аллергены: на местноанестезирующие препараты - артикаин, лидокаин, прокаин, бензокаин, мепивакаин, бупивакаин, прилокаин, тетракаин, эпинефрин; на ионы металлов - никель, хром, ртуть, медь, золото, платина, кобальт, палладий и на акрилат.

У 95 человек в возрасте от 19 до 54 лет были проведены кожные аппликационные пробы на сплавы металлов и акриловые пластмассы. Обследуемые были разделены на 2 группы. Первая группа была представлена здоровыми волонтёрами (n=30), у пациентов второй группы (n=65) был диагностирован атопический дерматит (АД). Для проведения кожных проб использовались пластыри с камерами-ячейками Finn Chamber (Финляндия). В ячейки помещались образцы сплавов металлов «НС», «Бюгодент», «Суперпал», «Супер КМ», изготовленные в виде пластин (толщиной 1 мм) и пластины из акриловых пластмасс «Этакрил», «Фторакс» и «Стомакрил», полимеризованные на водяной бане или СВЧ-методом. В ячейку пластыря укладывался образец и наклеивался на кожную поверхность верхней части спины на 48 часов. Результаты оценивали следующим образом: «-» - отрицательная реакция; «±» - сомнительная реакция (эритема, отёка нет); «+» - слабая реакция (эритема, инфильтрат); «++» - выраженная реакция (эритема, папулы или везикулы).

У 125 пациентов с атопической аллергией (АА), из которых 44 человека имели в анамнезе заболевание бронхиальной астмой и 81 человек - аллергический ринит, а также у 30 здоровых волонтёров определяли высвобождение гистамина из базофилов крови под действием СМ. Для исследования забирали 30 мкл капиллярной крови в пробирку с гепарином и центрифугировали. Образцы акриловых пластмасс «Этакрил», «Фторакс» и «Стомакрил», полимеризованные на водяной бане или СВЧ-методом были измельчены до порошкообразного состояния, а образцы сплавов металлов «НС», «Бюгодент», «Суперпал», «Супер КМ» до мелкой стружки, полученной твёрдосплавной фрезой. Полученные образцы в количестве 125 мг помещали в стерильные полипропиленовые пробирки и заливали 1 мл стерильного PIPES буфера (С2Н2O2Nа•ЗН20; К2СОз; Piperazine-N,N'-bis[2-ethanesulfonic acid]; Tris[hydroxymethyl]aminomethane; CaCl2I•H2O; KC1) («Sigms»). Взвесь периодически перемешивали на магнитной мешалке в течение 48 часов при 37°С и центрифугировали при 1250 об/мин в течение 15 минут. Затем в ячейки 96-луночных планшет заливали 25 мкл плазмы крови и добавляли по 25 мкл «супернатантов» исследуемых образцов, положительного и отрицательного контролей или только PIPES-буфера. Далее с использованием коммерческих наборов методом твёрдофазного иммуноферментного анализа на спектрофлюориметре Multiscan (Финляндия) в образце определяли содержание гистамина (нг/мл).

Исследования на определение специфических IgE и IgG антител в сыворотке крови и смешанной слюне проводили в лабораторных условиях компании «Дитрикс Медикал» г. Москва (главный врач ). У пациентов для исследования проводили забор 5 мл венозной крови и 2 мл смешанной слюны в стерильные стеклянные пробирки. Полученные образцы центрифугировали и на спектрофотометре Anthos 2020 методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием нитроцеллюлозных аллергодисков с иммобилизованными аллергенами по методу компании Dr.Fooke (EAST Specific IgE IgG Enzyme-Allergo-Sorbent-Test) в сыворотке крови и супернатанте слюны определяли специфические IgE и IgG антитела на артикаин, лидокаин, прокаин, бензокаин, мепивакаин, бупивакаин, прилокаин, тетракаин, эпинефрин, ионы никеля, хрома, ртути, меди, золота, платины, кобальта, палладия, на акрилат.

Статистическая обработка данных проведена на компьютере с использованием программы Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica 6.0. Данные представлены как среднее и стандартное отклонение для нормального распределения и как медиана и интерквартильный размах для распределения, отличного от нормального. Значимость различий для количественных переменных между группами оценивалась по критерию Вилкоксона и Манна-Уитни. Статистически значимыми считались различия при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования

В данной работе была предпринята попытка в опытах на мышах доказать влияние наиболее часто используемых в практике врача-стоматолога материалов на окружающие ткани и иммунный ответ на фоне изменённого аллергологического статуса. Ранее было показано, что динамика иммунного ответа у мышей при сенсибилизации сходна с таковой у человека, а использование большого числа линейных мышей позволяет получить статистически достоверные данные. К тому же подобного рода эксперименты позволяют после их завершения изучить у сенсибилизированных животных патоморфологическую картину тканей вокруг имплантируемого материала.

Согласно полученным данным введение ОА в организм мышей линии (СВА х С57 ВL/6)F1 приводило к развитию аллергической реакции, о чём свидетельствует рост уровня IgE и IgG антител в плазме крови. Содержание этих белков зависело от числа проведённых иммунизаций (рис.1). Как известно, уровень анти-ОА IgE в ответ на иммунизацию отражает аллергическую реактивность, а уровень анти-ОА IgG- преимущественно защитную реакцию иммунной системы против чужеродного белка. Определение количества этих белков после имплантации СМ до, во время иммунизации и после иммунизации позволяет оценивать иммуносупрессивный или иммуностимулирующий эффект имплантированных образцов.

Хотя данную модель только условно можно считать адекватной реальной стоматологической практике, но тестирование стоматологических материалов при помещении их в полость рта, в полной мере себя не оправдало ( с соавт., 2009).

Рис. 1. Изменение количества анти-ОА IgE и IgG в разные сроки иммунизации овальбумином. Условные обозначения: 1 – 2 нед. после первичной иммунизации; 2 – 1 нед. после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед. после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед. после третичной иммунизации; 5 – 3 нед. после третичной иммунизации.

Животным первой серии проводилась имплантация сплавов металлов, применяемых для ортопедического лечения. Данные об антителообразовании у сенсибилизированных ОА мышей в ответ на имплантацию сплавов «НС», «Бюгодент», «Суперпал» и «Супер КМ» представлены на рис.2 и 3. Имплантация образцов всех исследуемых сплавов металлов в процессе первичной иммунизации ОА вызывала подавление образования анти-ОА IgE. Сходные изменения наблюдались и на поздних сроках вторичной и третичной иммунизации при имплантации сплавов за 1 неделю до начала иммунизации, одновременно и через неделю после иммунизации ОА. Наиболее выраженное иммуносупрессивное действие оказывали образцы сплавов «НС» и «Суперпал».

В то же время, имплантированные одновременно и через неделю после иммунизации ОА образцы сплава «НС» на ранних сроках вторичной и третичной иммунизации усиливали образование анти-ОА IgE, тогда как имплантация образцов сплава «Супер КМ» и «Суперпал» через 3 недели после вторичной и через 3 недели после третичной иммунизации ОА приводила к уменьшению количества анти-ОА IgE. Относительно анти-ОА IgG образования в ответ на имплантацию образцов сплавов металлов выявлялась несколько иная картина.

А

Сроки забора крови

Б

Сроки забора крови

В

Сроки забора крови

Рис.2. Анти-ОА IgЕ ответ в крови мышей с имплантацией образцов сплавов металлов: А - за неделю до иммунизации; Б – одновременно с иммунизацией; В – через неделю после иммунизации. Условные обозначения: 1 – 2 нед. после первичной иммунизации; 2 – 1 нед. после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед. после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед. после третичной иммунизации; 5 – 3 нед. после третичной иммунизации; – НС; – Бюгодент; – Супер КМ; – Суперпал; – контроль ОА.

А

Сроки забора крови

Б

Сроки забора крови

В

Сроки забора крови

Рис.3. Анти-ОА IgG ответ в крови мышей с имплантацией образцов сплавов металлов: А - за неделю до иммунизации; Б – одновременно с иммунизацией; В – через неделю после иммунизации. Условные обозначения1 – 2 нед. после первичной иммунизации; 2 – 1 нед. после вторичной иммунизации; 3 – 3 нед. после вторичной иммунизации; 4 – 1 нед. после третичной иммунизации; 5 – 3 нед. после третичной иммунизации; – НС; – Бюгодент; – Супер КМ; – Суперпал; – контроль ОА.