Гемолитическая болезнь плода и новорожденного: собственные исследования в области иммуносерологической диагностики

Гемолитическая болезнь плода и новорожденного: собственные исследования в области иммуносерологической диагностики.

, ,

УЗ «Родильный дом Минской области»

ГУО «БелМАПО»

ГУ «РНПЦ гематологии и трансфузиологии»

Среди клинических форм иммунологически обусловленной патологии беременных важное место занимает гемолитическая болезнь плода и новорожденного, в частности, развивающаяся при изосерологической несовместимости по системе резус.

Как известно, диагноз резус-сенсибилизации устанавливается при выявлении антител в крови обследуемой. Титр антител является показателем их активности. Однако титр и биологическая активность антител не обязательно совпадают, так как указанный титр отражает зафиксированное количество антител в реакции с эритроцитами и не указывает на количество свободных антител в растворе.

Существует целый ряд различных методов определения антигенов и антител системы Резус [1, c.180-182, 92].

Наиболее распространенными способами выявления антирезус-антител являются прямая и непрямая пробы Кумбса с применением антиглобулиновой сыворотки [2, 3].

Прямая реакция Кумбса широко применяется для определения антител, уже фиксированных антигенами на поверхности эритроцитов. Непрямая проба Кумбса весьма широко применяется для выявления антител в сыворотке: при обследовании беременных, проведении пробы на совместимость крови, при посттрансфузионных осложнениях и так далее.

Диагностическое значение имеет не только абсолютное значение титра, но и его колебания на протяжении беременности [4, 5].

Целью данного исследования явилось определение диагностической ценности серологических (уровень антирезус-антител) показателей у беременных с резус-иммунизацией в качестве критерия диагностики и тяжести проявлений гемолитической болезни у плода.

Материалы и методы. В работе представлены результаты проспективного наблюдения беременности и родов у 48 женщин с наличием резус-иммунизации за период годы в УЗ «Родильный дом Минской области». В первую группу вошли 24 беременные женщины с высоким риском развития гемолитической болезни плода (по результатам анамнестических данных, исходов предыдущих беременностей, факта отсутствия своевременной специфической профилактики). Во вторую группу вошли 24 беременные женщины с невысоким риском развития гемолитической болезни плода. Кроме этого, изучались особенности клинико-лабораторного течения раннего неонатального периода и параметры метаболического мониторинга детей от матерей с наличием резус-иммунизации.

У беременных женщин 1 и 2 групп антирезус-антитела выявляли непрямой реакцией Кумбса при помощи стандартного универсального реагента (в пробирках без подогрева) с антисыворотками к глобулинам человека для пробы Кумбса (для исследовательских целей) производителя ГУ «РНПЦ гематологии и трансфузиологии» серии №№ 1.307; 3.307; 1.3.7.8; 9.12.7.8; 9.10.7.8; 3.10.07 [3].

Для установления фенотипа крови по системе Rh-Hr и специфичности антител первоначально проводилось определение резус-принадлежности крови при помощи стандартного универсального реагента (в пробирках без подогрева).

Далее сыворотку пациентки исследовали со стандартными сыворотками антирезус, содержащими антитела анти-С, анти-Е, анти-с и анти-е [3].

Для определения специфичности резус-антител сыворотку пациентки исследовали с помощью наборов стандартных эритроцитов, включавших редкие группы ссDee, Ccddee, ccddEe а также резус-отрицательные образцы (ссddee), включая как содержащие, так и не содержащие антигены Келл (К).

Результаты и обсуждение.

Существует мнение, что для тяжелых форм гемолитической болезни плода характерно раннее появление антител [4, c. 116, 51].

По вышеуказанному критерию нами проведен сравнительный анализ в обследуемых группах пациенток с резус-иммунизацией. Установлено, что сроки выявления антител у женщин 1 и 2 групп различались (таблица 1). У пациенток 1 группы антитела выявляли на более ранних сроках по сравнению с женщинами второй группы:недель против, р<0,01. Максимальный уровень антител у беременных 1-й группы был достоверно выше по сравнению с беременными второй группы: 1:16 (1:8-1:32) и 1:4 (1:4-1:16) соответственно, р<0,01.

Некоторыми авторами отмечено, что до 24 недель беременности перенос IgG через трансплацентарный барьер медленный, поэтому гемолитическая болезнь плода до этих сроков наблюдается редко [6, С.162]. Выявление антирезус-антител в сыворотке беременной до 20 недель гестации является неблагоприятным фактором для развития гемолитической болезни плода. В связи с этим, в группе беременных с высоким риском развития гемолитической болезни плода прогноз исхода беременности был более неблагоприятным. В данной группе мы ожидали большие перинатальные потери и высокий процент осложнений у новорожденных, связанный с вынужденным ранним родоразрешением и глубокой недоношенностью детей.

Таблица 1 – Сроки выявления антител и их максимальный уровень у беременных с резус-сенсибилизацией, (Ме, 25%-75%)

Группы	Гестационный срок выявления антител впервые (недели)	Максимальный уровень выявленных антител (титры)
1 группа (n=24)	17 (12-23)*	1:16 (1:8-1:32)*
2 группа (n=24)	34 (32-36)	1:4 (1:4-1:16)

Примечание - * достоверные различия в сравнении с аналогичными показателями во 2-й группе (р<0,01 по критерию Манна-Уитни).

Еще в 1978 году было предложено оценивать степень тяжести резус-сенсибилизации по исходному уровню титра антител:

- низкий титр ≤1/16 (выявленный антиглобуллиновым тестом);

- высокий титр 1/32 – 1/64 (выявленный антиглобуллиновым тестом);

- очень высокий титр ≥ 1/128 (выявленный антиглобуллиновым тестом) [7, с. 155].

По наблюдениям и между степенью изоиммунизации матери и тяжестью заболевания плода во многих случаях устанавливается прямая зависимость: при меньшем титре антител (от 1:2 до 1:16) чаще всего дети рождались здоровыми или с легкой формой гемолитической болезни. Тяжелая форма заболевания и гибель новорожденных наблюдались вышеуказанными авторами заметно чаще при величине титра от 1:32 до 1:2048 – 4096 [8, c. 166]. По данным , даже при низком титре 1:4 – 1:8 отмечены случаи рождения детей с тяжелой формой гемолитической болезни новорожденных (ГБН) [6, с. 118; 1, с. 134].

Анализ наших данных установил, что из 1 группы беременных, родивших младенцев с гемолитической болезнью, титр 1:4 был выявлен только у одной пациентки, 1:8 – у семи, двое из них впоследствии родили тяжелых детей, 1:16 – у девяти женщин, у пяти из которых отмечены дети с тяжелой степенью ГБН. Титр 1:32 был установлен у трех пациенток, все они имели детей с тяжелой степенью ГБН.

Титр 1:64 установлен у трех женщин, 1:128 – у одной. Несмотря на такой высокий уровень антител в крови беременных, новорожденные у этих матерей имели среднюю степень тяжести ГБН. Еще в 1974 году установил, что риск внутриутробной гибели плода возрастает на 10% при хотя бы однократно выявленном титре антител 1:16 [4, c.124].

При обследовании беременных 2 группы, дети которых имели гемолитическую болезнь, установлено, что у четырех пациенток в крови антитела не были найдены, однако у троих детей этих матерей была тяжелая степень ГБН. Титр антител 1:2 выявлен у одной женщины, 1:4 – у восьми беременных, впоследствии у 6 из которых родились дети в тяжелом состоянии. Уровень антител 1:8 был диагностирован у четырех беременных, 1:16 – у двух, 1:32 – у одной, 1:64 – у двух, титры 1:128 и 1:256 – у двух пациенток. Нами не установлено прямой корреляционной зависимости (r=0,02, p>0,05) между величиной титра антител у беременных и степенью тяжести гемолитической болезни у их новорожденных. По нашим наблюдениям тяжелые формы заболевания были отмечены как при высоком титре (1:32, 1:64), так и при невысоком титре 1:4, 1:8 антител.

Характер изменения титра антирезус-антител в сыворотке беременных клинических групп изучался в динамике. Постоянный уровень антител отмечен у 15 беременных, «скачущий» титр был выявлен у 16 пациенток, возрастающий характер титра в крови антирезус-антител был обнаружен у 13 пациенток. Реже мы выявляли снижающийся титр антител (у 4 обследованных) (р<0,05 по критерию χ2).

Данные о новорожденных с различной степенью тяжести гемолитической болезни в зависимости от уровня антител в сыворотке крови беременных с резус-иммунизацией представлены в таблице 2.

При рождении детей с ГБН средней степени тяжести у беременных чаще отмечался постоянный характер уровня антител по сравнению с возрастающим: 50,0% и 16,6%, р<0,05; снижающимся: 50,0% и 11,1%, р<0,05; «скачущим»: 50,0% и 22,2% (0,1>р>0,05). А вот в случаях рождения младенцев с тяжелой степенью ГБН изменения уровня антител во время беременности достоверно чаще имели «скачущий» характер в сравнении с постоянным: 42,9% против 17,9%, р<0,05; и «снижающимся»: 42,9% и 7,1% соответственно, р<0,05. При этом непостоянный характер уровня антител («скачущий», снижающийся, нарастающий) при тяжелой степени ГБН встречался достоверно чаще, чем постоянный уровень (82,1% против 17,9%, р<0,05 по критерию χ2).

Выявленные достоверные различия при сравнении характера изменений уровней антител во время беременности у резус-иммунизированных женщин свидетельствуют о том, что при нарастании титра и (или) «скачущем» характере их уровня гемолитическая болезнь новорожденных протекает более тяжело. Данные исследования согласуются с работами , , и др. [4, 9,10, 11].

Таблица 2 – Степень тяжести гемолитической болезни новорожденных в зависимости от уровня антирезус-антител во время беременности, %

Характер изменения титра антител во время беременности	Степени тяжести ГБН
Легкая степень (n=2)	Средняя степень (n=18)	Тяжелая степень (n=28)
Постоянный	50,0%(1)	50,0%(9)*	17,9%(5)**
Возрастающий	50,0%(1)	16,6%(3)**	32,1%(9)
Снижающийся	-	11,1%(2)**	7,1%(2)**
«Скачущий»	-	22,2%(4)	42,9%(12)*

Примечание – Различия между * и ** достоверны (р<0,05 по критерию χ2)

Согласно исследованиям (2005), (2007), установив фенотип крови отца и матери, можно прогнозировать вероятность развития гемолитической болезни у плода [1, с. 138; 6, с. 142]. Поэтому, помимо определения уровня антител сыворотку беременных первой группы, а также сыворотку их партнеров исследовали с целью установления фенотипа крови и специфичности антител. У всех обследованных пациенток с резус-иммунизацией был выявлен фенотип ссdee (100%). Их партнеры имели в 36,6% фенотип CCDEe, в 30,0% - ccDEe, в 16,6% - CcDEe, CcDee - у 6,6%, ccDEE – у 3,3%, у 6,6% - ccdee. Типирование эритроцитов пациенток и их партнеров выявило следующие особенности: фенотип kk имели 80,0% беременных, Kk – 20,0% пациенток; у 60,0% партнеров обследованных женщин выявлен фенотип kk, у 40,0% - Kk соответственно. При определении специфичности было установлено, что у 20 пациенток были выявлены только антиRh(D)-антитела, у четырех женщин наряду с антиRh(D)-антителами присутствовали антиrh(c)-антитела. Две пациентки имели кроме антиRh(D)-антител антиRh(C)-антитела. У одной женшины были выявлены антиrh(е)-антитела к имеющимся уже антиRh(D)-антителам. Одна пациентка имела антиRh(Е)-антитела. Антиэритроцитарных антител системы Келл-Челлана у обследованных беременных выявлено не было.

В случаях совпадения фенотипов у беременных и их партнеров, прогноз в плане развития гемолитической болезни у плода был наиболее благоприятным, что позволило в дальнейшем избежать необоснованных инвазивных лечебно-диагностических мероприятий у этой категории пациенток. В качестве подтверждения вышесказанного приводим описание клинического случая из нашей практики.

История наблюдения беременной № 000, 37 лет. Социальный статус – домохозяйка. Повторный брак. Беременность третья, роды вторые, один выкидыш в сроке 12 недель. Первая беременность закончилась в 1994 году срочными родами через естественные родовые пути. Родился здоровый ребенок с резус-положительной принадлежностью крови. Вес 4300,0 гр. Осложнений в родах и в раннем послеродовом периоде не было. Из экстрагенитальной патологии отмечен хронический гепатит С, хронический пиелонефрит, хронический холецистит. Гемотрансфузионный и аллергический анамнезы не отягощены. Впервые антирезус-антитела выявлены в 17 недель беременности, уровень титра составил 1:16, выявлены непрямой реакцией Кумбса. С целью прогнозирования развития гемолитической болезни, проводили типирование крови беременной и ее партнера. У беременной выявлен фенотип ccdee kk, ее партнер обладал ccdee kk-фенотипом. При исследовании специфичности антител беременной, установлено наличие неполных антиRh(D)-антител в титре 1:16 и антиrh(c)-антител в титре 1:8. Известно, что при наличии D- и c-антител одновременно у беременных с изоиммунизацией по системе Резус, прогноз для плода и исхода беременности гораздо хуже по сравнению с беременными, у которых выявляли только антиRh(D)-антитела [1, 6]. В данной ситуации фенотипический набор крови беременной и ее партнера был совершенно идентичен, что позволило нам предположить, что выявленные антитела на состояние данного плода влиять не будут. Очевидно, что сенсибилизация пациентки вызвана предшествовавшими беременностями.

В дальнейшем определение антител проводилось 1 раз до 30 недель, 2 раза – после 30 недель, а после 35 недель – 1 раз в неделю согласно протоколам диагностики и лечения. Ультразвуковые исследования плода с допплерометрическими измерениями проводили в 28, 32, 34 недели, а также накануне родов. Никакой патологии у плода выявлено не было.

Роды произошли 20.09.07 в 18 ч. 00 мин. через естественные родовые пути. В родах осложнений не было. Родился ребенок мужского пола, масса тела при рождении – 4070,0 г. Оценка по шкале Апгар составила 8/8 баллов. Диагноз новорожденного: неонатальный период. Послеродовой период у пациентки протекал без осложнений. Пуповинный остаток у младенца отпал на 4-е сутки. Ребенок с матерью выписаны домой на 5-е сутки после родов в удовлетворительном состоянии.

Следовательно, полное обследование с установлением фенотипа крови беременной и ее партнера, а также определение специфичности антител оказывает существенную помощь в прогнозировании развития гемолитической болезни у плода и исхода беременности у матери.

Необходимо отметить, что с июля 2009 года с целью выявления антител к антигенам эритроцитов и установления их специфичности в УЗ РДМО использовальзуются идентификационные карты ID-ДиаМед фирмы ДиаМед (Швейцария).

Диагностическая информативность данного метода составила 97,8% (ДИ95% 95,4-100,0) при чувствительности данного метода 96,6%, специфичности – 86,8%, р<0,01.

Выводы. Таким образом, наличие антител в сыворотке крови у пациенток с резус-иммунизацией, а также величина их титра не являются определяющими в диагностике гемолитической болезни плода. В то время, как характер изменения уровня антирезус-антител в сыворотке крови во время беременности при иммунологическом конфликте по системе резус имеет значение для прогнозирования степени тяжести гемолитической болезни новорожденных: при меняющемся титре антител («скачущем», возрастающем, снижающемся) достоверно чаще (82,7±7,1%, р<0,05) рождаются младенцы с тяжелой степенью заболевания.

Использование современных технологий с применением идентификационных карты ID-ДиаМед фирмы ДиаМед (Швейцария) позволяет диагностировать заболевание на более ранних этапах, а также своевременно оценить риск развития гемолитической болезни плода.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Донсков, крови системы Rhesus. Теория и практика / . – М.: ВИНИТ И РАН, 2005. – 392 с.

2. Донсков, взгляд на концепцию совместимой крови / , // Вестн. службы крови России. – 2004. – № 5. – С. 55-58.

3. Иммуносерология (нормативные документы) / авт. , . − Москва, 1998. − 195 с.

4. Косяков, болезнь новорожденных / // Косяков и изоантитела человека в норме и патологии. – М.: Медицина, 1974. – С. 199-208.

5. Марчак, течения ГБН при резус-конфликтной беременности / // Вестн. акушерства и гинекологии. – 1998. – № 2. – C. 5-7.

6. Минеева, крови человека. Основы иммуногематологии / П. Г Минеева. – СПб.: [б. и.], 2004. – 188 с.

7. Kochenour, N. K. Rh isoimmunization in pregnancy / N. K. Kochenour, R. S. James // Immunol. Obstet. Gynecol. – 1985. – Chapt.6. – P. 141-163.

8. Сидельникова, болезнь плода и новорожденного / , . – М.: Триада-Х, 2004. – 192 с.

9. Мордухович, и роды при изоиммунизации / . – Ташкент: Медицина, 1972. – 135с.

10. Меркулова, диагностика гемолитической болезни новорожденных / // Акушерство и гинекология. – 2004. – № 5. – С. 42-44.

11. Васильева, И. А. К изучению антигистаминового препарата цитраль при изосенсибилизации организма беременной / // Акушерство и гинекология. – 1959. – № 1. – С. 24.