Механизм снижения летальности антихолинэстеразными ядами при сепсисе
В 1987 году [1] и в последующих работах [2,4], нами было показано, что холинергическая стимуляция антихолинэстеразными ядами, в частности, фосфорорганическими соединениями (ФОС) существенно снижает летальность белых мышей от сепсиса, вызванного внутрибрюшинным или внутрилегочным введением E. coli, а в 1995 году была доказана целесообразность использования холиномиметиков (в том числе, ацетилхолина - АХ) для экстренной активации неспецифической антимикробной резистентности организма при различных инфекционных процессах [2,4]. В многочисленных публикациях [7,10,11,12] исследована роль активации холинергической системы в увеличении выживаемости животных при сепсисе, вызванном различными инфекционными процессами, и ее связь с продукцией провоспалительных цитокинов [9,14,15].
Снижение летальности мышей после холинергической стимуляции [1,2] в настоящее время называют в литературе «холинергическим противовоспалительным механизмом» («cholinergic anti-inflammatory pathway») [6,9,11,13]. Исследователи считают, что возбуждение α7н-холинорецептора (α7nAChR) АХ, продуцирующим нервными окончаниями n. vagus [7,9,11,12], приводит к подавлению продукции провоспалительных цитокинов моноцитарно-макрофагальной системой (ММС), вызывающей снижение летальности животных при сепсисе и различных инфекционных процессах [6,8,9,14,15].
В настоящее время существует необходимость в доказательстве того, что «парадоксальное» снижение летальности животных в ранней фазе сепсиса (инфекционного процесса) после острого отравления фосфорорганическими соединениями - ФОС [1,2,4] обусловлено снижением продукции фагоцитарно-моноцитарной системы - ФМС (моноцитами, макрофагами, нейтрофилами) [8,11] и лимфоидными дендритными клетками [5] провоспалительных цитокинов фактора некроза опухоли-α (ФНОα), ИЛ-1β и ИЛ-6 [9,14,15].
Целью исследования являлось оценка роли ацетилхолина и провоспалительных цитокинов ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-6 в снижении летальности от сепсиса мышей, вызванного экспериментальным перитонитом, при остром отравлении ФОС.
Опыты проводили на неинбредных белых мышах обоего пола массой 18-22 г. Холинергические средства (холиномиметики) - ФОС (зарин, диметилдихлорвинилфосфат - ДДВФ) и АХ хлорид - вводили подкожно однократно в дозах 0,5 DL50 (DL50 зарина, ДДВФ и АХ составляли соответственно - 0,15+0,02 и 64,5+2,3; 40,0+5,3 мг/кг. Через 6 ч у мышей вызывали сепсис внутриперитонеальным введением 2·109 суточной культуры микробных тел E. coli [1,14]. Регистрацию летальности мышей проводили с применением и без применения холинергических средств (ФОС и АХ) через 10 и 25 ч после моделирования септического процесса. Концентрацию цитокинов ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-6 исследовали в плазме крови выживших мышей через 10 и 25 ч в контроле и после внутриперитонеального введения E.coli (с использованием и без использования холинергических средств) методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Кровь для исследований забирали из хвостовой вены. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.
При исследовании летальности белых мышей после моделирования сепсиса с применением и без применения холинергических средств установлено (табл. 1), что зарина, ДДВФ и АХ через 10 ч после внутриперитонеального введения E. coli АХ приводили к снижению (p<0,05) исследованного показателя в на 28-36%, а через 25 ч –на 24-32% (p<0,05).
Таблица 1
Влияние холинергических средств (ФОС и ацетилхолина) на летальность мышей после моделирования сепсиса (М+m, n = 25)
Серии опытов | Срок исследования летальности после введения E. coli, ч | |
10 | 25 | |
Контроль (сепсис) | 56,0±9,9 | 84,0±7,3 |
Зарин+сепсис | 28,0±9,0* | 56,0±9,9* |
ДДВФ+сепсис | 24,0±8,5* | 52,0±10,0* |
АХ +сепсис | 20,0±8,0* | 60,0±9,8* |
Примечание: * -p<0,05 по сравнению с контролем.
При изучении концентрации цитокинов в плазме крови мышей (табл. 2) установлено увеличение содержания ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 через 10 ч при сепсисе по сравнению с контролем соответственно в 4,9; 13,8 и 19,3 раза (p<0,05).
Таблица 2
Влияние холинергических средств (ФОС и ацетилхолина) на изменение концентрации провоспалительных цитокинов в плазме крови мышей при сепсисе, пг/мл (М+m)
Серии опытов | ФНОα | ИЛ1β | ИЛ-6 | |||
10 | 25 | 10 | 25 | 10 | 25 | |
Контроль | 34±5 (6) | 37±4 (6) | 25±3 (6) | 20±3 (6) | 30±4 (6) | 35±4 (6) |
Сепсис | 167±18* (6) | 65±21˚ (4) | 346±38*˚ (6) | 135±45*˚ (4) | 578±60*˚ (6) | 375±73*˚ (4) |
Зарин+сепсис | 65±7** (6) | 45±6˚ (6) | 117±14**˚ (6) | 39±5**˚ (6) | 198±20**˚ (6) | 118±13**˚ (6) |
ДДВФ+сепсис | 82±9** (6) | 54±5*˚ (6) | 147±16**˚ (6) | 51±7**˚ (6) | 180±22**˚ (6) | 98±20**˚ (6) |
АХ+сепсис | 73±8** (6) | 48±5˚ (6) | 138±15**˚ (6) | 44±6**˚ (6) | 221±22**˚ (6) | 133±16**˚ (6) |
Примечание: 10 и 25 – срок после моделирования сепсиса, ч; в скобках – число животных в опыте; * - p<0,05 по сравнению с контролем; ** - p<0,05 по сравнению с контролем и показателем при сепсисе; ˚ -p<0,05 по сравнению с показателем через 10 ч.
Содержание ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 в крови мышей после отравления зарином с последующим моделированием сепсиса через 10 ч уменьшалось по сравнению с параметрами при экспериментальной инфекции без применения ФОС соответственно в 2,6; 3,0 и 2,9 раза (p<0,05).
Концентрация в крови ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 после интоксикации ДДВФ с последующим моделированием инфекционного процесса по сравнению показателями при сепсисе без применения ДДВФ через 10 ч уменьшалось соответственно в 1,5; 2,4 и 2,6 раза (p<0,05).
Аналогичные изменения концентрации в крови провоспалительных цитокинов вызывало применение АХ. Так, содержание ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 в плазме крови животных через 10 ч снижалось соответственно в 2,3; 2,5 и 2,6 раза (p<0,05) по сравнению с концентрацией цитокинов при сепсисе без использования АХ. При этом их значения достоверно (p<0,05) превышали контрольные показатели.
Через 25 ч содержание в крови цитокинов ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 существенно снижалось (p<0,05) по сравнению с концентрацией, зарегистрированной через 10 ч. Содержание цитокинов в крови через 25 ч оставалось выше контрольных значений (p<0,05), за исключением уровня ФНОα при воздействии зарина и АХ, который был увеличен незначимо (p>0,05) – соответственно в 1,2 и 1,3 раза.
Полученные результаты позволяют полагать, что АХ при острой интоксикации ФОС, воздействуя на α7nAChR моноцитов, макрофагов и нейтрофилов [8,9] (возможно, и естественных клеток-киллеров [2]), реализует «холинергический противовоспалительный механизм» [1,2,4,15], снижая в крови и органах ФМС, включая селезенку, печень и желудочно-кишечный тракт, содержание провоспалительных цитокинов ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6, вызывающих различные патологические реакции, приводящие к летальному исходу при сепсисе (и других инфекционных патологических состояниях) [11,12].
Уменьшение в крови ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-6 характеризует редукцию их синтеза макрофагами, моноцитами, естественными клетками-киллерами (эти клетки продуцируют ФНОα [5]) и лимфоидными дендритными клетками вследствие воздействия АХ после острого отравления ФОС на их холинергические рецепторы. Продукция ИЛ-6 Th2-лимфоцитами (и клетками Th0-типа) в ответ на введение белковых антигенов (E. coli) начинается в период формирования иммунного ответа только через 5-7 сут после попадания в организм антигена [5].
Установленное нами в предыдущих экспериментах «парадоксальное» снижение летальности животных через 1-2 сут после острой интоксикации ФОС (зарином, VX, инсектицидами) [1,4], обратимыми и необратимыми ингибиторами холинэстеразы, применяемыми в медицине [1,4], обусловлено не только воздействием АХ (в частности, на α7nAChR макрофагов, моноцитов и нейтрофилов [11]), но и активацией гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы с последующим увеличением в крови кортикостероидов [3,4].
ВЫВОДЫ
1. ФОС (зарин, ДДВФ) в эквилетальных дозах (0,5 DL50) при их введении за 6 ч до моделирования сепсиса вызывают существенное снижение летальности мышей от экспериментального инфекционного процесса.
2. ФОС обусловливают редукцию концентрации в крови провоспалительных цитокинов ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-6 при моделировании сепсиса.
3. Выявленные эффекты ФОС связаны с воздействием ацетилхолина, так как его эквилетальная доза обусловливает аналогичные изменения летальности животных и содержания провоспалительных цитокинов в крови при сепсисе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Забродский армина на факторы неспецифической резистентности организма и первичный гуморальный ответ //Фармакол. и токсикол. 1987. Т 49. №2. С. 57-60.
2. Забродский антиинфекционной неспецифической резистентности организма под влиянием холинергической стимуляции // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1995. Т. 119, № 8. С.
3. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2000. Т. 129, № 5. С. 552-555.
4. , Мандыч ксенобиотиков: Монография. СВИБХБ, 20с.
5. Бростофф Дж., Иммунология. М.: Мир, 20с.
6. Anderson J. The inflammatory reflex-introduction// J. Intern. Med. 2005. Vol. 257, №2. P. 122-125.
7. Giebeleh I. A., Leendertse M., Florquin S. Stimulation of acetylcholine receptors impairs host defence during pneumococcal pneumonia // Eur. Respir. JVol. 33, №2.-P. 375-381.
8. Hauber H. P., Zabel P. Pathophysiology and pathogens of sepsis // J. Immunol. 2009. Vol. 50, №7. P. 779-780.
9. Kessler W., Traeqer T., Westerholt A. The vagal nerve as a link between the nervous and immune system in the instance of polymicrobial sepsis // Langenbecks rg. 2006. Vol. 391, №2. P. 83-87.
10. Liu C., Shen F. M., Le Y. Y. Antishock effect of anisodamine involves a novel pathway for activating alpha7 nicotinic acetylcholine receptor // Crit. Care Ned. 2009. Vol. 37, №2. P. 778-779.
11. Oke S. L., Tracey K. J. From CNI-1493 to the immunological homunculus: physiology of the inflammatory reflex // J. Leukoc. Biol. 2008. Vol. 83, №3.P. 512-517.
12. Pavlov V. A. Cholinergic modulation of inflammation // Int. J. Clin. Med. 2008. Vol. 1, №3.-P. 203-212.
13. Rosas-Ballina M., Tracey K. J. Cholinergic control of inflammation // J. Intern. Med. 2009. Vol. 265, №6. P. 663-679.
14. Song D. J., Huanq X. Y., Ren L. C. Effect of lentiviral vector encoding on triggering receptor expressed on myeloid cells 1 on expression of inflammatory cytokine in septic mice infected by Bacteroides fragilis // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2009. Vol. 25, №1. P. 36-41.
15. Vos A. F., Pater J. M., Pangaart P. S. In vivo lipopolysaccharide exposure of human blood leukocytes induces cross-tolerance to multiple TLR ligands. // J. Immunol. 2009. Vol. 183, №1. P. 533-542.
