Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота (стр. 5 )

“- ” отрицательный результат

Разработанная диагностическая тест-система полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять в биологических образцах патогенный биотип АВ F. necrophorum subsp. necrophorum.

Диагностическое исследование биологических образцов из пораженных конечностей на некробактериоз бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией тождественно.

ПЦР с гнездовыми праймерами для выявления F. necrophorum subsp. necrophorum может быть использована в качестве экспресс-метода для диагностики кожной формы некробактериоза.

2.2.3 Определение роли специфической профилактики в системе контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого скота.

2.2.3.1 Регламент получения антигена Fusobacterium necrophorum и
постановка реакции агглютинации

В настоящее время нет единого антигена для обнаружения антител против возбудителя некробактериоза F. necrophorum. Каждый исследователь готовит собственный антиген (АГ) для РА на основе полученных изолятов. В доступной отечественной литературе мы не встретили работ, сообщающих о методике изготовления антигена F. necrophorum для РА, утвержденной директивными органами РФ. Ранее в своих исследованиях РА использовали ученые ВИЭВ (, 1948, , 1993), НИИСХ Крайнего Севера (, 1973).

Исходя из имеющихся сведений, мы поставили перед собой задачу разработать регламент приготовления АГ F. necrophorum и методику постановки РА.

2.2.3.1.1 Выбор культуры (изолята) в качестве антигена

Для исследования взяли 10 культур F. necrophorum, выделенных от больных некробактериозом животных с разной клинической формой.

Все культуры F. necrophorum хорошо росли на среде Китта-Тароцци или аминокровин-сывороточном бульоне (АКСБ) при температуре 37ºС. Десять исследуемых культур выделяли газы сероводород и индол, не расщепляли углеводы.

Культура F. necrophorum “ИВ” вызывала агглютинацию взвеси эритроцитов 5%-ой концентрации в разведении 1:32. Культура “Тл” агглютинировала 5%-ую взвесь эритроцитов до разведения 1:16, культуры “Ор1”, “Bn2”, “Эл”, “В” только до разведения 1:4. Слабой агглютинирующей способностью обладали культуры “Н”, “Ор2” - до разведения 1:2.

Вирулентные свойства культур F. necrophorum изучали на белых мышах. По данным таблицы 2 можно отметить, что наиболее патогенным для мышей оказалась культура “ИВ” F. necrophorum. На месте инъекции культуры “ИВ” F. necrophorum у всех мышей образовался некроз тканей. Она вызвала гибель всех мышей через 5-7 дней.

Культура F. necrophorum “Тл”, вызвала образование некроза на месте инъекции у всех животных в опытной группе. Гибель мышей составила 66,7 % через 7-8 дней в группе.

Таблица 2 – Результаты изучения патогенности культур F. necrophorum на мышах

Название культур F. necrophorum	Количество мышей	Время образования некроза (сутки)	Количество павших, гол./%	Время наступления летального исхода (сутки)
“Bn2	3	6	1/33,3	7
“Н”	3	6	0/0	-
“ИВ”	3	5	3/100	5-7
“Ор1”	3	8	0/0	-
“Ор2”	3	9	0/0	-
“Тл”	3	7	2/66,7	7-8
“Ол”	3	7	1/33,3	8
“Эл”	3	7	1/33,3	7
“Алт”	3	8	1/33,3	7
“В”	3	7	1/33,3	7
Контроль	3	-	-	-

Культуры “Bn2”, “Ол”, “Эл”, “Алт”, “В” также вызвали некроз тканей у всех мышей. Гибель животных составила 33,33% в каждой группе. Культуры “Н”, “Ор1”, “Ор2” вызвали некроз тканей на месте инъекции бактериальной взвеси, но все мыши оказались живыми.

В контрольной группе животных на месте инъекции физиологического раствора воспаления не обнаружено, все мыши остались живыми.

Таким образом, по данным реакции гемагглютинации и изучения вирулентных свойств культур F. necrophorum наиболее патогенной для мышей оказалась культура “ИВ”. Культура F. necrophorum “ИВ” выделена из пораженной конечности коровы. Летальная доза (LD50) Fusobacterium necrophorum “ИВ” для мышей составила 9,77 млн. микробных клеток (9,77 · 107м. к.). На основании проведенных исследований для приготовления антигена отобрана культура Fusobacterium necrophorum “ИВ”, которая принята на депонирование Научно-исследовательским институтом Коллекции культур микроорганизмов (НИИ ККМ) Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор”.

Принятая культура Fusobacterium necrophorum “ИВ” в НИИ ККМ получила регистрационный номер: B-845 (справка № 000 от 18 сентября 2000 г.), и определяется нами как штамм Fusobacterium necrophorum ИВ B-845.

Методика приготовления антигена и постановки реакции агглютинации выглядит в следующем виде.

2.2.3.1.2 Методика приготовления антигена F. necrophorum и техника
постановки РА

Культуру выращивали двое суток на среде Китта-Тароцци, затем для получения большого количества бактериальной массы Fusobacterium necrophorum ее пересевали на специальную среду аминокровин-сывороточный бульон (АКСБ). Бактериальные клетки освобождали от среды путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин, промывали физиологическим раствором. Для предотвращения самоагглютинации АГ осадок клеток Fusobacterium necrophorum ресуспендировали в фосфатном буфере рН 7,6 до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту. Исследуемые пробы сыворотки крови животных также разводили в фосфатном буфере.

Антиген инактивировали 0,4%-ым раствором формалина. Стерильность антигена определяли путем посева на среды Китта-Тароцци, МПА, МПБ.

Основные этапы постановки реакции агглютинации следующие: 1. Готовили основное разведение каждой испытуемой сыворотки крови; 2. Готовили рабочие разведения каждой пробы сыворотки; 3. На следующем этапе работы во все пробирки с разведенными сыворотками вносили антиген. Для контроля антигена с целью исключения самоагглютинации в 1 мл фосфатного буфера добавляли 0,1 мл антигена. Штатив с пробирками помещали в термостат при температуре 37°С на 15-18 часов, а затем выдерживали при комнатной температуре 2-3 часа, после чего учитывали реакцию агглютинации визуально и оценивали ее в крестах.

Показатели агглютинации в пробирках на четыре, три или два креста характеризуются как положительная реакция. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация с оценками на два, три или четыре креста, считали ее титром.

2.2.3.2 Изготовление и апробация вакцины ГОА ИЭВСиДВ

2.2.3.2.1 Определение иммунизирующей дозы вакцины.

На основании лабораторных исследований нами разработан регламент изготовления вакцины на основе штамма Fusobacterium necrophorum ИВ B-845, стимулятора резистентности и адъюванта гидроокиси алюминия. Для определения иммунизирующей дозы вакцины сформировали семь групп животных: шесть опытных и одна контрольная, в каждой группе было по 4 коровы. Коровам опытных групп № 1, 3, 5 вакцину вводили однократно, а № 2, 4, 6 дважды с интервалом три недели. Доза вакцины для животных групп № 1 и 2 – 1 мл, № 2 и 4 - 3 мл, № 5 и 6 - 5 мл. Животные 7-ой группы (контроль) не были вакцинированы. Титры антител в пробах сыворотки крови животных определяли при помощи разработанной нами реакции агглютинации (табл. 3).

Таким образом, на основании результатов этих исследований в качестве иммунизирующей взята доза вакцины 3 мл, как более экономичная и достаточно иммуногенная.

Таблица 3 – Титры антител сыворотки крови коров, иммунизированных разными дозами вакцины

Группа, кратность введения	Доза вак-цины	Титры антител (lg)
перед опытом	через 14 дней	через 1,5 мес.	через 3 мес.	через 5мес.	через 6 мес.
I/1	1 мл	2,3±0,05	2,45±0,04	2,5±0,05	2,5±0,05	2,3±0,03	2,3±0,04
II/2	1 мл	2,3±0,06	2,5±0,07	3,0±0,03*	2,6±0,08**	2,45±0,05	2,3±0,02
III/1	3 мл	2,3±0,04	3,0±0,05*	3,0±0,04*	2,8±0,04*	2,5±0,07	2,3±0,02
IV/2	3 мл	2,3±0,04	3,0±0,05*	4,2±0,03*	3,5±0,04*	3,0±0,05*	2,4±0,06
V/1	5 мл	2,4±0,07	3,0±0,06*	3,0±0,05*	2,9±0,07*	2,5±0,04	2,3±0,08
VI/2	5 мл	2,2±0,04	3,1±0,04*	4,3±0,05*	3,6±0,04*	3,0±0,06*	2,4±0,09
VII (Контроль)		2,3±0,04	2,3±0,07	2,2±0,05	2,3±0,06	2,2±0,08	2,3±0,04

Примечание: достоверный уровень значимости по отношению к контролю