Фармакологічне вивчення протизапальної активності густого екстракту листя горобини звичайної (стр. 2 )

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Об`єктом дослідження є густий екстракт листя горобини звичайної (ГЕЛГЗ), отриманий на кафедрі фармако­гнозії НФаУ під керівництвом доц. . Екстракт є густою речо­ви­ною темного кольору з різким запахом. Основними діючими речовинами ГЕЛГЗ є флавоноїди (3,14% в перерахунку на рутин) та гідроксикоричні кислоти (4,57% в перерахунку на хлорогенову кислоту), супутніми – дубильні речовини, вуглеводи (поліцукри, моноцукри), амінокислоти, органічні та жирні кислоти (бурштинова, оцтова), ізопреноїди (терпеноїди), вітаміни (С, каротин), макро - та мікроелементи (, 2010, 2013).

Як препарати порівняння використовували диклофенак натрію – «Воль­та­рен» виробництва «Novartis Pharma» (Швейцарія) таблетки, вк­ри­ті оболонкою, 0,025; індометацин – «Індометацин-ретард» виробництва «Сті­рол­біофарм» (Ук­раї­на) капс. 0,075; кверцетин – «Гранули кверцетина» ПАТ НВЦ «Борщагівській ХФЗ» (Україна) 2,0; метамізол натрію – «Анальгін-Дарниця» ФФ «Дарниця» (Україна), таблетки 0,5; силімарин – «Карсіл» «Sopharma» (Болгарія), таб­летки, вк­ри­ті оболонкою, 22,5 мг.

Експериментальне вивчення протизапальної активності ГЕЛГЗ включало дослідження його антиексудативної, мембраноза­хис­ної, антиаль­теративної, ре­па­ра­тивної, антипроліферативної дії; визначення анальгетичної та жаро­знижувальної активності, поглиблене вивчення ефективності ГЕЛГЗ на моделях запалення суглобів та печінки (з перевагою ексудації, аль­терації, проліферації).

ГЕЛГЗ вводили внутрішньошлунково, при вивченні антиексудативної актив­ності – в дозах 25; 75, 100 та 150 мг/кг маси тіла щурів, для подальших дослід­жень була обрана умовно-ефективна доза 100 мг/кг. Референтного препа­рати вво­дили внутрішньошлунково: дикло­фенак натрію, індометацин та метамізол натрію в дозах EД50 – 8 мг/кг, 10 та 50 мг/кг, відповідно (, 2001); кверцетин та силімарин – у вигляді тонко диспергованих суспензій у очищеній воді, стабілізо­ваних емульгатором твіном-80, кверцетин – в умовно-ефектив­ній дозі, яка скла­дає 5 мг/кг (, 2006) та силімарин в дозі – 100 мг/кг (, 2000).

Дослідження виконано на 259 статевозрілих білих щурах масою 180-230 г, 24 мишах-самцях масою 15-24 г, вирощених у розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ, відповідно до вимог GLP, згідно з методичними реко­мендаціями ДЕЦ МОЗ України (, 2001), Національними «Загаль­ними етичними принципами експериментів на тваринах» (Україна, 2001) та ухвалою Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2007). Дотримання етич­них норм підтверджено комісією з біоетики НФаУ (протокол № 3 від 20.03.2013). Дослідження проводили у ЦНДЛ НФаУ, що сертифікована ДЕЦ МОЗ України (посвідчення № 21 від 30.04.2009 р.).

Усі дослідження були виконані згідно з методичними рекомендаціями «Доклінічні дослідження лікарських засобів» (, 2001). Гостру токсичність ГЕЛГЗ при внутрішньошлунковому введенні визначали на щурах та мишах у широкому діапазоні доз 1000-10000 мг/кг. Спостереження за тваринами здійснювали протягом двох тижнів. Критеріями оцінки гострої токсичності була клінічна картина інтоксикації: загибель тварин, загальний стан. На основі отриманих даних встановлювали середньо­летальні дози ГЕЛГЗ та визначали клас токсичності препарату ( и соавт.,1977).

Скринінгові дослідження антиексудативної дії ГЕЛГЗ проводили на моде­лях карагенінового та зимозанового набряків. Оцінку антиальтеративної активності виучуваного екст­ракту проводили на моделі некротич­них виразок, антипроліферативної дії – на моделі ватної гранульоми у щурів. Аналгетичну дію ГЕЛГЗ вивчали на моделі вісце­рального болю за методом оцтовокислих корчів у щурів, оцінку жарознижувальної активності – на моделі молочної лихоманки у щурів. Етапи фармакологічного дослідження протизапальної дії ГЕЛГЗ та експериментальні моделі наведено на рис. 1.

Рис. 1. Схема фармакологічного вивчення протизапальної дії ГЕЛГЗ.

 

Однією з моделей для вивчення ефективності проти­запальних засобів, яка вважається адекватною ревматоїдному артриту у людини, є модель ад’ювантного артриту (, 2001). Вплив ГЕЛГЗ та препарату порівняння на розвиток і перебіг ад’ювантного артриту оцінювали за їх здатністю зменшувати набряк кінцівок, знижувати загальну кількість лейкоцитів, рівень ШОЕ, загального білка (ЗБ), вміст сіалових кислот (СІК), лужної фосфатази (ЛФ), активність аланінамі­нотрансферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсАТ), вміст ТБК-актив­них продуктів (ТБК-АП) у сироватці крові експери­ментальних тварин.

Об`єм лап вимірювали за допомогою механічного онкометру за А. С. За­хар­жевським на 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 та 22 добу експерименту. Загальну кількість еритроцитів та ШОЕ протягом досліду реєстрували три рази: початковий фон (до введення препа­ратів), на 12 та 22 добу. Лейкоцити підраховували в камері Горяєва, ШОЕ визначали за мікрометодом , активність АсАТ, АлАТ – за методом Райтмана-Френкеля, вміст СІК – за методом Гесса, ЛФ – за методом Бесселя-Лоурі-Брока, рівень ЗБ – за біуретовою реакцією (набори реактивів виробництва НВП «Філісіт-Діагно­стика», Україна), ТБК-АП – за реакцією з 2-тіо­барбітуро­вою кислотою спектрофото­метрично за методом І. Д. Стальної, ішвілі (1977). Морфоло­гічні дослідження суглобів за допомогою уніфікованих методів світлової мікроскопії ( и соавт., 2002) проведено на ба­зі ХНМУ за консультації доцента каф. гістології та ембріології ХНМУ Дєєвої Т. В.

Поглиблене вивчення протизапальної дії ГЕЛГЗ проводили також на моделі хронічного тетрахлорметаново-етанолового гепатиту у щурів (, 2001). Стан пе­чінки оцінювали за масовим коефіцієнтом печінки (МКП), показником виживання тварин та біохімічними показниками. У сироватці крові визначали: активність АлАт, вміст ЛФ, рівень ЗБ, сечової кислоти (СК), холес­теролу. У гомогенаті печінки визначали рівень ТБК-АП і ВГ ( і співавт., 2000). Швидкість виділення жовчі визначали за мето­дом ­говоз (2001), вміст жовчних кислот і холестеролу в жовчі – за методом В. П. Мірош­ни­ченка та співавт. (1978). Морфологічні дослідження печінки за допомогою уні­фіко­ваних методів світлової мікроскопії ( и соавт., 2002) проведено на ба­зі ЦНДЛ НФаУ за консультації ст. н.сп. Ларяновської Ю. Б.

Кількісні дані обробляли за допомогою програми статистичної обробки StatPlus 2009: за критерієм t Стьюдента – у разі нормального розподілу, за кри­те­рієм (W) Уайта – у разі його відсутності; внутрішньогрупові відмінності аналі­зу­ва­ли за парним критерієм T̃ Вілкоксона (, 2001; , 2006).

Результати та їх обговорення. Найважливiшою характеристикою потен­цiйних лікарських засобiв є безпечність, тому на першому етапi даного дослiдження було доцільним визначити гостру токсичність ГЕЛГЗ. У резуль­таті досліджень встановлено, що ГЕЛГЗ при одноразовому внутрішньо­шлунковому введенні тваринам в діапазоні доз з 1000 до 10000 мг/кг не має токсичного впливу. Отже, відповідно до класифікації речовин за токсичністю, ГЕЛГЗ належить до VІ класу токсичності – відносно нешкідливих речовин (LD50 > 10 000 мг/кг) ( и соавт.,1977).

Розвиток запалення характеризується вираженою ексудацією, тому в гострий період важливо призначити препарат з антиексудативною дією, що допомагає зменшити симптоми та уповільнити розвиток запального захво­рювання ( та співавт., 2005). Враховуючи вищенаведене, з метою визначення антиексу­дативної дії та умовно-ефективної дози на моделях гострого асептичного запалення була досліджена антиексудативна активність ГЕЛГЗ в діапазоні доз 25-150 мг/кг.

Вивчення антиексудативної активності ГЕЛГЗ проведено на моде­лях карагенінового та зимозанового набряку у щурів. Вибiр даних моделей обумовлений їх інформативністю, оскiльки на кожній стадії розвитку запалення (за рівних інших умов) переважне значення має певна група (або групи) медіа­торів, які беруть участь у розвитку ексудативної реакції (Boughton-Smith N. K., 1993). Різно­плановість механізму розвитку гострого ексу­да­тивного запалення на обраних моделях набряків дозволило досконаліше вив­чити особливості анти­ексудативної дії, передбачити механізм протизапальної дії та визначити умов­но-ефективну дозу ГЕЛГЗ, необхідну для проведення подальших досліджень.

Скринінгове дослідження ГЕЛГЗ з вивчення антиексудативної актив­ності по­ка­зало її наявність та залежність від дози ( табл. 1). Оскільки ГЕЛГЗ в до­зі 100 мг/кг виявив активність, що достовірно не відрізнялася від дози 150 мг/кг, то дозу 100 мг/кг ми вибрали як умовно-ефективну за протизапальною ак­тив­ністю. В подальших дослідженнях ми використовували ГЕЛГЗ у цій дозі. Дос­лід­жуваний засіб в умовно-ефектив­ній дозі 100 мг/кг виявляє виражені анти­ек­су­дативні властивості на рівні дії кверцетину (табл. 1).

Подальший аналіз динаміки антиексудативної дії ГЕЛГЗ та її вираз­ності на певну годину карагенінового та зимозанового набряку в порівнянні з ефек­том ре­фе­рентного препарату дозволили припустити можливі його механізми (рис. 2 а, б).

Таблиця 1

Вплив ГЕЛГЗ на перебіг карагенінового та зимозанового набряків

Досліджу­ваний препарат	Доза, мг/кг	Середня антиексудативна активність, в %
карагеніновий набряк (протягом 6 годин )	зимозановий набряк (протягом 4 годин)
ГЕЛГЗ	25	8,9	18,5
ГЕЛГЗ	75	28,7	26,0
ГЕЛГЗ	100	39,3	31,9
ГЕЛГЗ	150	43,0	34,3
Кверцетин	5	28,5	39,1

Отримані результати дозволяють припустити, що у механізмі анти­ексудативної дії ГЕЛГЗ певне місце належить пригніченню біогенних амінів (гістаміну, серотоніну), кінінів, меншою мірою – простагландинів, тому що ГЕЛГЗ був найбільш активним на 1-3 годину експерименту (фазу активізації біогенних амінів та кінінів).